Chương 2. VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. THỜI GIAN VÀ DIA DIEM NGHIÊN CỨU
2.3. PHUONG PHAP NGHIEN CUU
2.3.1. Phương pháp thu mẫu địa y
Mẫu địa y được lựa chọn làm mẫu phải đạt được yêu cầu có chứa các bào tử của nắm cộng sinh và đủ trưởng thành đẻ hạn chế khó khăn cho quá trình phân lập. Sau khi mảnh vỏ cây có chứa địa y được tách ra khỏi thân cây, nó được chụp ảnh. gói bằng giấy hút am hoặc giấy báo và dán nhãn có chứa day đủ các thông tin vẻ thời gian và địa điểm
21
thu mẫu. Cuối cùng. mẫu sé được mang về phòng thí nghiệm Sinh hóa — Vi sinh. trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đẻ tiền hành các bước phân lập.
2.3.2. Phương pháp phân lập nam cộng sinh
Mẫu vỏ cây có chứa địa y sau khi được mang về phòng thí nghiệm cần phải được phân lập ngay hoặc bao quản trong tủ đông thời gian bảo quản tối đa 7 ngày tinh từ ngày thu mẫu ghi trên nhãn. Các bước tiên hành phân lập được thực hiện dựa trên tài liệu [50]
như sau; Dau tiên, mẫu được rửa dưới vòi nước chảy liên tục trong thời gian 15 phút nhằm mục dich loại bỏ bụi ban. Tiếp theo, mẫu được tiệt trùng bằng cách ngâm trong côn 70° trong thời gian 30 giây. Sau đó, mẫu được rửa trong nước cất tiệt trùng 3 lan mỗi
lần tối thiêu 30 giây. Mẫu được cắt nhỏ bằng dao mô hoặc dao lam và được chuyền lên lam kính tiệt trùng, quan sát dưới kính hiển vi. Bào tử mycobiont được hút bằng micropipette và đưa lên môi trường MY10. Các thao tác trong quá trình phân lập đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
2.3.3. Phương pháp nuôi nắm cộng sinh địa y
Nắm cộng sinh địa y được cắt nhỏ đạt đến kích thước khoảng | — 2 mm bang dao
mo tiệt trùng hoặc kim mũi mác tiệt trùng, sau đó mẫu được đặt lên môi trường nuôi cay
được tuyên chon (MY 10, PDA, S4). Các mẫu được nuôi trong điều kiện tối, nhiệt độ 18
+2°C thời gian theo nghiệm thức (3 thang, 4 tháng, 5 tháng). Các thao tác trong suốt quá trình thực hiện đều phải đảm bảo điều kiện tiệt trùng.
2.3.4. Phương pháp tạo cao methanol
Nắm cộng sinh với địa y sau khi được phân lập và nuôi cay dat dén thoi gian phù
hợp với nghiệm thức sẽ được tạo cao methanol với các bước tiên hành như sau: Đầu tiên,
sinh khôi tươi của nam địa y được thu và say khô ở 50°C. Sau khi say, sinh khối khô được cân khối lượng và được xay khô. Sau đó, sinh khối đã được xay được ngâm trong dung môi methanol theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 1 - 2 ngày. Tiếp theo, hỗn hợp sinh khỗi
và methanol được lọc lại nhằm mục đích thu địch lọc, sau đó địch lọc được cô chân
22
không. Hỗn hợp cao chiết sau khi cô chân không được đề bay hơi hết dung môi. sau
khoảng 7 ngày cao methanol hoàn chỉnh đã được tạo ra [51].
2.3.5. Phương pháp tính hiệu suất cao
Các mẫu nắm được nghiền nhuyễn, cân khối lượng, tận chiết trong methanol (mẫu sẽ được ngâm và thay dung môi theo tỉ lệ 1:1 cho đến khi dung môi không đôi màu).
Dung dịch ngầm mẫu sẽ được gộp lại cô chân không vả đề bay hơi tự nhiên trong nhiệt
độ phòng thời gian 7 ngày. Cao chiết thu được sẽ được cân, biệu suất cao chiết được xác định theo tài liệu [52] cu thé công thức như sau:
m cao khô
%H =———————v 100
m mẫu
Trong đó:
m cao khô: khối lượng cao khô (g).
m mẫu: Khôi lượng sinh khối khô (g).
2.3.6. Phương pháp kháo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng DPPH
Nguyên tắc: Các chất có khá năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại. Màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dan, chuyên từ tím sang vàng cam. Nếu khi cho vào dung dịch DPPH mau cần thử có kha nang trung hòa hoặc vây quanh các gốc tự do sẽ khiến cường độ hap thu
ánh sáng của các gốc tự do DPPH bị giảm. Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hap phụ ánh sáng cúa dich thí nghiệm so với đối chứng được đo trên máy đo
mật độ quang OD ở bước sóng 517 nm [35].
Quy trình tiền hành:
Đâu tiên, mẫu cao chiết nam địa y được pha loãng thành nồng độ 1000 pg/ml trong dung môi methanol. Dung địch DPPH được pha bằng methanol thành nông độ 0,08 mM.
Tiếp theo. 1 ml DPPH và 0.2 ml mẫu cao được cho vào ông eppendorf, đối với mẫu đối
chứng âm thay mẫu cao bằng methanol, đối chứng dương thay mẫu cao bằng acid ascorbic 30 ug/mL , trộn đều và ủ trong nhiệt độ phỏng va trong điều kiện không có ánh
23
sáng 30 phút. Cuối cùng hỗn hợp đã ủ được do mật độ quang OD với bước sóng 517 nm và tính tỉ lệ phần trăm loại bỏ góc tự do của từng nghiệm thức theo công thức:
ỉ@0c = 0Dm ODC
Ti lệ loại gốc tự do DPPH (%) = x 100
Trong đó:
ODm: giá trị mật độ quang của mẫu.
ODc: giá trị mật độ quang của chứng âm.
2.3.7. Phương pháp khảo sát năng lực khử theo Oyaizu
Nguyên tắc: Chất khử sẽ khử potassium ferricyanide (Ks[Fe(CN)s]) thành
potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)s]). lon Fe** trong phân tử potassium ferricyanide bị
khử thành Fe** trong phân tử potassium ferrocyanide [13]
X + K3[Fe(CN)s] > Ka[Fe(CN)s]
(X + [Fe(CN)s]** > [Fe(CN)ô]**)
Khi bô sung Fe**, FeŸ* sẽ phan ứng với ion ferrocyanide tạo thành một phức hợp
ferris ferrocyanide mau xanh đương cú cụng thức Fes[Fe(CN)ô]s. Phức hợp nảy cú độ
hấp thu cực đại tại bước sóng 4 = 700 nm.
4Fe?* + 3[Fe(CN)s]!*—= Ee[Fe(CN)s]› (màu xanh)
Cường độ màu tỉ lệ thuận với ion ferrocyanide được tạo thành. Do đó, cường độ
mau cảng cao nang lực khử càng mạnh. Cường độ màu được xác định bằng cách đo mật
độ quang ở bước sóng A = 700 nm.
Quy trình khảo sát năng lực khử được tiến hành như sau:
Các mẫu cao chiết pha trong methanol 20% thành hỗn hợp nông độ 1000 ug/ml.
Hút | ml cao chiết đã pha vào ông nghiệm, đối với mẫu chứng đương thay cao chiết bằng ascorbic acid, chứng âm thay cao chiết bang methanol. B6 sung 2,5 ml dung dịch đệm sodium phosphate và 2,5 ml dung dịch potassium ferricyanide 1%. U hỗn hợp vừa pha trong bê ủ nhiệt trong điều kiện 50°C, 20 phút. sau khi ủ xong làm lạnh nhanh hỗn hợp.
Thêm vào hỗn hợp 2,5 ml dung dịch TCA 10% đẻ dừng phản ứng. Hỗn hợp được li tâm 3000 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Sau đó. hút 2,5 ml dich nỗi vào ông nghiệm bé
24
sung 2.5 ml nước cất và 0.5 ml dung dịch FeCh 0,1% dé 10 phút cho phản ứng xảy ra.
Cuối cùng hỗn hợp được đo mật độ quang OD ở bước sóng 700 nm. Năng lực khử được xác định bằng cách so sánh với chứng đương.
2.3.8. Phương pháp khảo sát hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase
Thí nghiệm được chuẩn bị như sau: Các mẫu cao chiết được khảo sát hoạt tính sẽ được pha trong dung môi DMSO 5% thành nòng độ 200 pg/mL, cơ chất pNPG 5 mM được pha trong dung địch đệm phosphate (pH = 6,88). Enzyme được pha thành nông độ 0.2 U/mL trong dung dịch đệm phosphate. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Đầu tiên, trên đĩa 96 giếng cho vào các giếng 40 L enzyme a-glucosidase bỗ sung thêm 50 uL mẫu, đôi với đối chứng âm thay mẫu bằng 50 pL DMSO 5%, trộn đều và ủ
trong điều kiện 37°C thời gian 20 phút. Tiếp theo, thêm vào hỗn hợp vừa ủ 40 pL pNPG, tiếp tục ú trong 20 phút với điều kiện tương tự lần tủ đầu tiên, lấy mẫu ủ ra bỗ sung thêm
130 pL NasCOa 0,2 M dé phan ứng dừng lại. Hỗn hợp sau phản ứng được đo mật độ
quang OD với bước sóng 405 nm bằng máy đọc đĩa BMG Labtech Clariostar. Tỷ lệ phần trăm ức chế enzyme được xác định theo công thức sau [27]:
ODc — ODm
—————————x100
% Uc chế = TP
Trong đó:
ODe: giá trị mật độ quang của mẫu đối chứng âm.
ODm: giá trị mật độ quang của mẫu.
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả thu được dưới dạng trung bình + độ lệch chuẩn. Các kết quả thu được nhập liệu và xử lí bằng phần mém Microsoft Excel
2016.
25