Mẫu nắm sau khi được phân lập và được tạo đòng thuần (không có sự xuất hiện của nam hoặc vi sinh vật khác) bằng cách cấy truyền nhiêu lần trên môi trường MY10.
Quá trình sinh trưởng cụ thé được trình bày dưới đây.
Hình 3.1. Nắm địa y trên môi trường MY10 sau 1 tháng nuôi cấy
Hình 3.2. Nam địa y trên môi trường MY10 sau 3 tháng nuôi cấy
26
khả năng bám trên thạch kém. Sau 3 tháng nuôi trong điều kiện không có ánh sáng nắm có những đặc điểm sinh trưởng mới cụ thé nam phát triển theo hướng to dan về đường kính. Hình dang ban dau cho thay nam phát triển với hình dang gần như tròn, nam có phát triển về chiều cao tuy nhiên rất ít. Trên bề mặt của khuẩn lạc nắm vẫn còn màu trắng Và có sự xuất hiện của các lỗ nhỏ li tỉ va bắt đầu tiết ra dịch trong màu vàng nhạt và dịch màu đen, môi trường nuôi cấy không só sự thay đôi về màu sắc. Đến tháng thứ 4, kích thước nắm chưa thẻ hiện được sự khác biệt so với nam được nuôi cay 3 thang, trén bề mặt khuân lạc nắm có một sé vùng dan chuyén sang mau vang nau nhat, cac lỗ li ti trên bề mặt khuẩn lạc vẫn tiếp tục tiết ra dịch mau đen. Đến tháng thứ 5, kích thước nắm có
27
sự thay đôi rõ rệt đường kính khuẩn lạc nam tang, hình dang khuẩn lạc tương đối tròn, chiều cao của khuẩn lạc có sự tăng trưởng. Màu sắc khuẩn lạc chuyển hoàn toàn sang
màu vàng nâu nhạt. Các lỗ trên nam không còn tiết dich bề mặt khuẩn lạc nam khô ráo.
Môi trường nuôi cay không có sự thay đổi về màu sắc và trạng thái.
Trên môi trường PDA và S4 nắm địa y cũng có một số sự khác biệt về quá trình sinh trưởng cụ thé được trình bày thông qua các hình ảnh được ghi nhận lại đưới đây:
Hình 3.6. Nam cộng địa y trên môi trường PDA thời gian 4 tháng
Hình 3.7. Nam địa y trên môi trường PDA thời gian 5 tháng
Hình 3.8. Nắm địa y nuôi trên môi trường S4 thời gian 3 tháng
Hình 3.9. Nam địa y trên môi trường S4 thời gian 4 tháng
Hình 3.10. Nam địa y trên môi trường S4 thời gian 5 tháng
Nắm cộng sinh địa y được nuôi cấy trên môi trường PDA trong thời gian đầu nuôi cấy khuẩn lạc có các đặc điểm tương tự khi nuôi cấy trên môi trường MY 10 (khuẩn lạc màu trăng, có sợi nắm, khuân lạc hình tròn). Sinh trưởng đến tháng thứ 3 khuan lạc có các đặc điểm mới, nắm phát triển cả về chiều ngang và chiều cao, trên bề mặt của khuẩn lạc có xuất hiện lỗ nhỏ, không tiết dịch, màu sắc khuẩn lạc dan chuyển từ trắng sang
vàng nhạt sau đó thành màu vàng nâu, độ bám trên thạch kém. Đến tháng thứ 4, màu sắc khuẩn lạc nắm chuyền sang màu vàng nâu, phan ria xung quanh còn non sẽ có màu trắng.
Kích thước chiều ngang không có sự thay đôi nhiều chiều cao của nam có sự thay đôi.
Dinh của khuẩn lạc nắm nhô cao, ban đầu có màu trắng và dần chuyển sang màu vàng nâu. Thời gian nuôi đến tháng thứ 5, khuan lạc nắm hau như đã chuyên sang màu vàng nâu hoàn toàn, bề mặt khuân lạc khô ráo, không có dịch tiết ra. Kết cấu khuẩn lạc nắm không được vững chắc dé bị phá hủy cau trúc khi có tác động. Trong suốt thời gian nuôi cay nam địa y được nuôi trên môi trường PDA khả năng liên kết giữa khuan lạc nam và thạch môi trường không cao dé bị tách rời khi có tác động từ bền ngoài.
Khi được nuôi cấy trên môi trường S4 nắm cộng sinh địa y ban đầu cũng có các đặc điểm khuẩn lạc màu trắng, có sợi nam tương tự như khi được nuôi cấy trên môi trường MY 10 va PDA. Thời gian nuôi cấy được 3 tháng (Hình 3.8) , chủng có kích thước lớn hon, hình dang vòng nắm không tròn như khuẩn lạc nắm được nuôi cấy trên MY 10.
Mau sắc trên bề mặt khuẩn lạc nam không đều những khu vực còn non sẽ có màu trắng, những khu vực khác tùy vào độ già mà màu sắc có sự khác biệt sự thay đổi màu từ khuẩn
30
lac nam non đến khi già sẽ thay đôi theo hướng trắng chuyển sang vàng nhạt sau đó thành vàng nâu nhạt, một số điểm trên bề mặt khuẩn lạc có lỗ và tiết dich vàng nhạt và trong suốt. Đến tháng thứ 4, khuẩn lạc nam có sự thay đôi rất nhỏ vẻ kích thước hoặc không thay đôi. Màu sắc trên khuan lạc màu vàng nâu nhạt chiếm chủ yêu những phan non mới mọc ở phan ria sẽ có màu trăng. Dịch tiết ra ở nắm chuyển dan sang mau đen, giai đoạn này lượng dịch nam tiết ra không nhiều. Sau 5 tháng nuôi cấy khuẩn lạc nắm cộng sinh có sự thay đôi về kích thước cả chiêu cao và chiều ngang. Trên bề mặt khuẩn
lạc có nhiều dich nam mau den tiết ra từ các lỗ nhỏ trên bề mặt khuan lạc nam.
Nhìn chung, sau khi được phân lập và nuôi cấy trên ba môi trường MY 10, PDA và S4 nam cộng sinh địa y có những đặc điểm sinh trưởng giống nhau trong giai đoạn đầu của quá trình sinh trưởng. Khi thời gian nuôi cấy nắm càng dài sự khác nhau của môi trường có ảnh hưởng đến hình thái biêu hiện bên ngoài của khuẩn lạc nắm cộng sinh địa y. Đáng chú ý ở đây là khả năng tiết dịch của nắm và thời gian tiết dịch có sự khác nhau khi nuôi cay ở các môi trường khác nhau.
3.2. Hiệu suất tạo cao
Cao methanol từ nam cộng sinh địa y Graphis cf. persicina được tạo theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.3. Kết quả hiệu suất tạo cao được trình bày trong bảng
3.1.
Từ kết quả được trình bày trong bảng 3.1, nhìn chung hiệu suất tạo cao từ sinh khối nam được nuồi ở môi trường nuôi cấy khác nhau, trong thời gian khác nhau là khác nhau.
Cao methanol từ nam địa y Graphis cf. persicina được nuôi trong thời gian 3 tháng (MY 10-3M) có hiệu suất cao nhất (43.86%) gấp 5,5 lần so với nghiệm thức có hiệu suất
tạo cao thấp nhất là PDA-4M (7,94%). các mẫu nam được nuôi trên môi trường MY 10
có hiệu suất cao hơn so với tất cả các nghiệm thức nuôi trên các môi trường khác tại cùng một thời điểm thu sinh khối. Nam cộng sinh địa y được nuôi ở các môi trường và thời gian thu sinh khối khác nhau sẽ cho kết quả hiệu suất cao khác nhau cụ thể xét theo
từng loại môi trường nuôi cây.
31
Bảng 3.1. Hiệu suất tạo cao methanol từ nam cộng sinh dia y Graphis cf. persicina Sinh khéikhé6 Khối lượng cao
(g) (g)
MY10-3M 5,14 2,2544 43.86
1
2 | MY10-4M 1,90 0.4086 21,51
4 | PDA-3M 8,63 0,9502 11,01
:
6 7
8
9
STT | Nghiệm thức Hiệu suất (%)
Đầu tiên, cao methanol được tạo ra từ nắm nuôi trên môi trường MY10 tại thời điểm 3 tháng (MY10-3M) cho hiệu suất cao nhất (43,83%). Trong các nghiệm thức được nuôi cây trên cùng môi trường. đến tháng thứ 4 (MY10-4M) hiệu suất giảm đi khoảng một nửa so với thời gian 3 tháng. Đến tháng nuôi cấy thứ 5 (MY10-5M), hiệu suất tạo cao tăng khoảng 1.72 lần so với thời gian 4 tháng.
Các nghiệm thức trên môi trường PDA, ở tháng thứ 3 (PDA-3M) hiệu suất cao thu được là 11,01%, đến tháng thứ 4 hiệu suất cao chiết giám khoảng 1.4 lần (7.94%). Ngược lại, đến tháng thứ năm hiệu suất cao chiết tăng 1,6 lần (18,28%) so với nghiệm thứ 3 tháng và cao nhất so với các hiệu suất của các nghiệm thức cùng môi trường nuôi cấy.
Cuối cùng, đối với các nghiệm thức trên môi trường S4. ở thời gian nuôi cấy 3 tháng (S4-3M), kết quả hiệu suất tao cao đạt 11,15%, hiệu suất tăng lên cao nhất ở tháng thứ 4 (S4-4M) đạt 13.04% (tang 1,89%). Đến tháng thứ 5 (S4-5M) hiệu suất tạo cao giảm xuống còn §,05% thấp nhất so với tat cả các nghiệm thức trên cùng môi trường
nuôi cay.
32
3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp bấy gốc tự do
DPPH của nắm cộng sinh địa y Graphis cf. persicina
Cao methanol của nam cộng sinh với địa y Graphis cf. persicina được tiên hành thử hoạt tính kháng oxy hoá theo phương pháp bẫy gốc DPPH đã được trình bày ở mục
2.3.4. Kết qua thí nghiệm được trình bày trong bang 3.2.
Dựa vào kết quả được trình bày ở bảng 3.2 có thê nhận định rằng tất cả các nghiệm thức đều có hoạt tính kháng oxy hóa yếu ở nồng độ 1000 pg/mL, với nghiệm thức có ti
lệ kháng oxy hóa cao nhất là MY 10-5M (31,87%) và thấp nhất là nghiệm thức PDA-3M
(6,52%).
Xét theo môi trường nuôi cấy khác nhau khả năng kháng oxy có sự khác nhau ở
các điều kiện môi trường cụ thể ở 3 nghiệm thức được nuôi trên môi trường MY10 (MY10-3M, MY10-4M, MY10-5M) và PDA (PDA-3M, PDA-4M, PDA-5M) cho thay kha nang ức chế gốc tự do không có xu hướng tang dan hoặc giảm dan ti lệ ức chế theo
độ dài thời gian nuôi nam. Ở môi trường MY 10, khi thời gian nuôi cấy 3 tháng tỉ lệ bay góc tự do ở mức 28.54%, đến tháng thứ 4 tỉ lệ phần trăm bay gốc DPPH giảm còn 15,85%
(giảm 1,8 lần). Tuy nhiên, đến tháng nuôi cấy thứ 5, tỉ lệ này tăng đến 31,87% so sánh với tháng thứ 4 khả năng bay góc DPPH tăng khoảng gap 2 lần. Đối với môi trường nuôi cay PDA so sánh tỉ lệ ức chế gốc tự do ở nghiệm thức 3 tháng (6,52%) với nghiệm thức 4 tháng (13,34%) và 5 tháng (8,33%) có thé kết luận rang tỉ lệ kháng oxy hóa của nghiệm thức PDA-4M tăng khoảng gấp 2 lần so với nghiệm thức PDA-3M và tỉ lệ nảy giảm khoảng 1,6 lần so với nghiệm thức PDA-SM. Tỷ lệ phần trăm bẫy gốc DPPH của cao
chiết nam cộng sinh địa y Graphis cf. persicina trên môi trường S4 (S4-3M, S4-4M, S4-
5M) được đánh giá là có sự tỷ lệ thuận giữa thời gian nuôi cấy đến tỉ lệ kháng oxy hóa cụ thé trong khoảng thời gian nuôi cay 3 tháng kha năng bay gốc DPPH đạt 10.3%, đến tháng 4 khả năng này tăng lên khoảng gấp 1.67 lần (17,27%) và tiếp tục tăng ở tháng thứ
5 đạt tỷ lệ 21,83% (tăng khoảng gap 1,3 lần so với nghiệm thức 4 tháng).
33
Bảng 3.2. Tỉ lệ bẫy gốc tự do DPPH của cao methanol ở nồng độ 1000 pg/mL
Nghiệm thức | Tỉ lệ bẫy gốc tự do DPPH (%)
MY 10-3M 28,51 + 0,16 MY 10-4M 15,85 + 0,47 3 | MY10-5M 31,87 + 0,50
vw Ww
ww +
Xét tại cling | thời điểm giữa các môi trường khác nhau, tại thời gian 3 tháng
nghiệm thức MY 10-3M có hoạt tính cao nhất, thấp nhất là nghiệm thức PDA-3M. Đến tháng thứ 4, hoạt tính của nghiệm thức S4-4M thê hiện mạnh nhất, thấp nhất là nghiệm thức PDA-4M. Tháng thứ 5, hoạt tính kháng oxy hóa của nghiệm thức MY10-5M thé
hiện mạnh nhất cao gap 3,83 lần so với nghiệm thức có hoạt tính yếu nhất là PDA-5M.
Nhìn chung, cao chiết nam trên môi trường PDA đều có hoạt tính thấp nhất tại 3 thời điểm. Thời điểm 4 tháng cao S4-4M có hoạt tính cao nhất, các thời điểm còn lại cao nam trên môi trường MY 10 cho hoạt tính cao nhất.
So sánh với đối chứng đương là vitamin C (96,8%) nhìn chung tat cả các nghiệm thức đều có tỉ lệ bay gốc tự do thấp hơn rất nhiều so sánh với nghiệm thức có hoạt tính cao nhất, vitamin C có hoạt tính cao gấp 3,04 lần.
Khi so sánh hoạt tính kháng oxy hóa với hiệu suất cao có thê thấy hiệu suất tạo cao
càng lớn không quyết định khả năng kháng oxy hóa của cao methanol. Cụ thể, hiệu suất tạo cao của nắm cộng sinh trên môi trường MY l0 trong thời gian 3 tháng (MY 10-3M)
34
cao nhất nhưng hoạt tính kháng oxy hóa vẫn thấp hơn cao chiết trên cùng môi trường tại
thời gian 5 tháng.
Tóm lại, thời gian và môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxy hóa của cao methanol từ nắm cộng sinh địa y Graphis ef. persicina.
3.3. Kết quả khảo sát năng lực khử
Cao chiết methanol của nắm cộng sinh địa y Graphis cf. persicina được khảo sát
năng lực khử theo phương phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.5. Kết quả thí
nghiệm được trình bày trong hình 3.11, số liệu được trình bày trong bảng 3.2.
Hình 3.11. Kết quả khao sát năng lực khử của cao chiết methanol nồng
độ 1000 pg/mL
(Chú thích: Từ trái sang phải: Doi chứng âm, MY! 0-3M, MY10-4M, MY10-5M, PDA-
3M, PDA-4M, PDA-5M, S4-3M, S4-4M, S4-5M, doi chứng dương ascorbic acid 300 pg/mL)
Dựa vào kết quả được trình bày ở bảng 3.3 có thé nhận định tất cả 9 nghiệm thức
được khảo sát đều có năng lực khử thấp. Nghiệm thức có năng lực khử cao nhất là S4- 5M (25,33%) và nghiệm thức có nang lực khử thấp nhất là PDA-5M (7,52%) . Các loại cao chiết có nắm địa y được thu trên môi trường MY 10 (MY10-3M, MY10-4M, MY 10-
5M) va môi trường S4 (S4-3M, S4-4M, S4-5M) có năng lực khử cao hơn trên môi trường PDA (PDA-3M, PDA-4M, PDA-5M).
Xét trên cùng môi trường tại các thời diém khác nhau có thé nhận định thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng đến năng lực khử của cao methanol của nam cộng sinh địa y Graphis cf. persicina cụ thê trên môi trường MY 10, thời gian 3 tháng hoạt tinh kháng
35
oxy được thé hiện thấp nhất đến tháng thứ 4 hoạt tính thé hiện cao nhất gấp 1,13 lần.
Đến tháng thứ 5 hoạt tính giảm nhẹ so với tháng thứ 4. Trên môi trường PDA, năng lực khử của các nghiệm thức dao động liên tục tại các thời điểm khác nhau cụ thé tại tháng thứ 3 nang lực khử của cao chiết đạt 10,08%, đến tháng thứ 4 hoạt tinh tăng lên cao nhất gap 1,38. Đến tháng thứ 5 hoạt tính giảm xuống thấp nhất (7,52%). Trên môi trường S4, nhìn chung thời gian nuôi cấy tỉ lệ thuận với năng lực khử của cao chiết nắm cộng sinh.
Cụ thé, tại thời gian 3 tháng năng lực khử thấp nhất (15,25%) đến tháng thứ 4 tỉ lệ tăng
lên 19,57% và tiếp tục tăng đến thang thứ 5 năng lực khử đạt 25,33%. Từ kết quả so sánh này có thé nhận định thời gian nuôi cay có ảnh hưởng đến năng lực khử của cao chiết nắm cộng sinh địa y.
Bảng 3.3. Tỉ lệ năng lực khử của cao chiết methanol nồng độ 1000 pe/mL
STT Nghiệm thức | Năng lực khử (%)
MY10-3M 19,65 + 0,24 MY 10-4M 22.28 + 0,40
MY 10-5M 21,28 + 0,28 PDA-3M 10.08 + 0,36
PDA-4M 13,89 + 0,17
PDA-5M 7,52 +0,13
S4-3M 15,25 + 0,33 S4-4M 19,57 + 0,26 S4-5M 25,33 + 0,58
Xét tại cùng thời điểm trên các môi trường khác nhau có thé nhận thay tại cả 3 thời điểm các nghiệm thức trên môi trường MY 10 có năng lực khử cao nhất, các nghiệm thức thé hiện năng lực khử thấp nhất đều được nuôi trên môi trường PDA. Từ kết quả so sánh này có thê nhận định môi trường nuôi cây có ảnh hưởng đến năng lực khử của cao chiết
£ a . .
nam cộng sinh dia y.
36
Khi so sánh năng lực khử với hiệu suất cao có thể thay hiéu suat tao cao càng lớn không quyết định năng lực khử của cao methanol. Cụ thẻ, hiệu suất tạo cao của nam cộng sinh trên môi trường MY10 trong thời gian 3 tháng (MY10-3M) cao nhất nhưng năng lực khử vẫn thấp hơn một số cao chiết khác (MY 10-4M, MY 10-5M, S4-5M).
Tóm lại thời gian và môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến năng lực khử của cao methanol từ nam cộng sinh địa y Graphis cf. persicina.
3.4. Kết qua ức chế enzyme a — glucosidase
Cao methanol từ nam cộng sinh địa y Graphis cf. persicina được khảo sát khả năng ức chế enzyme œ-glucosidase theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.6. Kết qua Thí nghiệm được trình bay trong hình 3.4.1, số liệu được trình bày cu thé trong bảng 3.3.
Cơ chất pNPG khi phan ứng với enzyme a-glucosidase sẽ được phân cắt thành phân cắt thành p-nitrophenol và D-glucose. Lượng p-nitrophenol được tạo ra sau phản ứng càng nhiều đồng nghĩa với lượng enzyme a-glucosidase tham gia phan ứng càng cao. Khả năng hoạt động của chất ức chế enzyme a-glucosidase ty lệ nghịch với lượng
p-nitrophenol. như vậy nghĩa là màu vàng của hỗn hợp sau phản ứng càng nhạt chứng tỏ
khả năng ức chế enzyme a-glucosidase của mẫu càng cao [53].
Từ kết quả được trình bày trong bảng 3.3. có thê nhận định rằng môi trường nuôi cay có ảnh hưởng đến hoạt tính ức chế enzyme œ-glucosidase của cao methanol từ nam
cộng sinh địa y Graphis cf. persicina. Hoạt tính được thẻ hiện cao nhất ở nghiệm thức MY10-5M với kha năng ức chế khoảng 56,11%, các nghiệm thức con lại thẻ hiện khả năng ức chế yếu hoặc rat yếu. So sánh với nghiệm thức đối chứng dương acarbose ở
nông độ 200 ug/ml (24.99%) nhận thay các nghiệm thức MY10-3M (38,35%). MY 10- 5M (56,11%), S4-4M (29,88%) có khả năng ức chế cao hơn so với đối chứng đương. Cụ thé, đối chứng đương có khả năng ức chế kém hơn so với MY 10-3M 1,5 lần, MY 10-5M 2,3 lần và so với S4-4M 1,2 lan. Các nghiệm thức còn lai (MY 10-4M, PDA-3M, PDA- 4M, PDA-5M, S4-3M, S4-5M) có khả năng ức chế thấp hơn so với nghiệm thức đối
chứng dương.
Hình 3.12. Kết quả thí nghiệm ức chế enzyme ơ-glucosidase của cao
TaN _ I OF 4 ` 7 ~~ ~ - ~~
methanol từ nam cộng sinh dia y Graphis cf. persicina nồng độ 200 pg/ml
(Chú thích: Al-10: Blank; BI, DI, C1: Đối chứng âm; B2, C2, D2: MY10-3M; B3, C3,
D3: MY10-4M; B4, C4, D4: MY10-5M; BŠ, C5, D5: PDA-3M; B6, C6, D6: PDA-4M;
B7, C7, D7: PDA-5M: BS, C8, D8: S4-3M; B9, C9, D9: S4-4M; B10, C10, D10: S4-5M)
Bang 3.3. Tỉ lệ ức chế enzyme ơ-glucosidase của cao methanol và acarbose nồng
độ 200 pg/ml
STT | Nghiệm thức | Tỉ lệ ức chế (%)