Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các nhóm phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu gồm nhóm phương
pháp nghiên cứu ngoài thực địa và nhóm phương pháp trong phòng thí nghiệm 2.2.1. Nhóm phương pháp ngoài thực địa
2.2.1.1. Phương pháp thu mẫu ốc
Oc được thu từ các kênh cấp nước cho ruộng lúa bằng cào có kích thước 25cm x 25cm và cào sâu 10cm, mắt lưới rộng 0,5cm. Tiền hành lay mau ốc bang cào cách bờ Im và cào hướng vào mép bờ kênh [31]. Tại mỗi kênh cấp nước thu mẫu tại 5 vị
trí khác nhau tại, tại mỗi vị trí cào 1 cào, các điểm thu cách nhau 100m. Nhiệt độ. pH.
độ mặn, độ sâu được đo tại mỗi điểm thu và ghi chép lại.
Sau khi cào, chao qua chao lai cao trên kênh đề rửa sạch bùn đất, sỏi, đá tạp trong cào. Số lượng ốc thu được trong mỗi cào được đem đi rửa sạch bùn đất và cho vào các túi vải âm dé thoáng khí có dán nhãn, đánh dấu riêng biệt. Sau đó các tui vải đựng ốc được chuyên về phòng thí nghiệm Động vật - Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh đề phân tích thành phan loài c va kiểm tra Cercariae.
Oc được thu trong 2 đợt nghiên cứu: | đợt vào mùa mưa (tháng 10/2023) và một đợt vào mùa khô (tháng 1/2024). Tổng thu 30 kênh cấp nước cho ruộng vào mỗi đợt với 5 diém/kénh và 1 cao/diém thu.
Số lượng điểm mẫu thu: 30 kênh trong | đợt với tong số điểm thu mẫu trên các kênh là 150 diém/dot tương đương 150 cào.
2.2.1.2. Phương pháp điều tra phỏng van
Tiên hành điều tra phỏng van người dân ở sinh sống tại khu vực xung quanh kênh thu mẫu (N=30) vẻ các thông tin của kênh cấp nước cho ruộng (chiều dai, độ sâu,...), cách thức khai thác sử dụng kênh, ốc trong kênh, phương thức bơm, cấp nước
cho ruộng cập mé kênh....
2.2.2. Nhóm phương pháp được sử dụng tại phòng thí nghiệm
2.2.2.1. Phương pháp định danh ốc
Oc đem về được rửa sạch dưới vòi nước và định danh phân loại theo đặc điểm hình thái bên ngoài vỏ ốc gồm số vòng xoắn, chiều xoắn. lỗ ron, kích thước vỏ. chiều cao tháp ốc, màu sắc,...
Hình 2.2. Một số đặc điểm vỏ ốc nước ngọt [32]
Đối chiếu và so sánh theo mô ta tại các tài liệu phân loại của Đặng Ngọc Thanh,
Thái Tran Bái, Phạm Văn Miên trong “Định loại Động vật khong xương nước ngọt
Bắc, Việt Nam” [33], “Ho ốc văn ( Viviparidae — Gastropopa) ở Việt Nam” của Dang Ngọc Thanh, Hồ Thanh Hai, Dương Ngọc Cường [34] và “An overview of freshwater
snails in Asia with main focous on Vietnam” của H. Madsen và N.M. Hung [35]. Sắp
xếp các đơn vị phân loại lớp chân bung theo hệ thống phân loại của Molluscabse [36].
Xác định loài ngoại lai xâm hại theo Thông tư số 35/2018/TT-BTNMT [37].
Chụp hình ốc: chọn tâm nhựa có nền xanh, kích thước phù hợp đề làm nền chụp hình mẫu ốc. Rửa sạch bùn và rêu bám trên ốc, lau khô đề giảm độ bóng nước khi chụp, đặt ốc lên trên tam nhựa, phía đưới mẫu ốc đặt thước đo đề cho thay kích thước
thật. Chụp 6c ở cả mặt trước và mặt sau dé thay rõ các đặc diém hình thái của vỏ, nap
miệng lỗ rốn miệng, tháp ốc, số vòng xoắn.
27
2.2.2.2. Phương pháp kiểm tra Cercariae
Oc thu được khi mang vẻ phòng thí nghiệm sau khi phân loại ốc sẽ tiễn hành kiêm tra Cercariae trên ốc. Kiểm tra Cercariae là quá trình xét nghiệm ốc đề kiểm tra xem ốc có nhiễm ấu trùng sán lá song chủ (giai đoạn Cercariae), trong nghiên cứu này sử dụng hai phương pháp kiêm tra Cercariae nhằm bao quát tỉ lệ nhiễm Cercariae trong gan ốc và Cercariae thải ra ngoài môi trường.
s* Phương pháp shedding:
Pau tiên. sử dụng phương pháp kiêm tra Cercariae kinh điển là dé Cercariae tự thoát ra ngoài (shedding) theo Frandsen va Christensen (1984), gồm các bước sau
[38]:
Bước 1: Rửa sạch bùn đất, rong rêu bám trên vỏ ốc bằng chỗi rửa dụng cụ thí nghiệm. Việc chà rửa vỏ ốc đóng vai trò hết sức quan trọng giúp loại bỏ cặn bản giúp
nước ngâm ốc trong nên để quan sát Cercariae khi soi mẫu nước.
Bước 2: Cho từng cá thé ốc đã chà sạch vào từng cốc nhựa nhỏ trong suốt, riêng biệt có đường kính 6em và chiều cao là 3em và chế nước ngập khoảng Icm dé ngâm qua đêm hoặc ít nhất 4 đến 6 tiếng.
Bước 3: Sáng hôm sau. kiếm tra Cercariae thoát ra ngoài môi trường nước ngâm ốc bằng kính soi ni.
Lưu ý, lắc nhẹ cốc nước ngâm ốc dé Cercariae chuyển động. quan sát tang mặt trước rồi điều chỉnh hạ kính kiểm tra mặt đáy cốc.
Bước 4: Đối với những cốc quan sát thấy nghi nhiễm Cercariae (dùng bút đánh dau lại) sau đó dùng ống hút, hút bắt lay Cercariae trong môi trường nước, nhỏ 1 giọt lên lam vả đưa vào kính soi nỗi kiểm tra giọt môi trường trên lam có chứa Cercariae không nếu không thì tiến hành bat, hút lại Cercariae đến khi có được ít nhất một
Cercariae trên lam kính.
Lưu ý: đối với những cốc Cercariae thải ra ít. khó hút được chế nước ngâm ốc có chứa Cercariae qua đĩa petri dé hút bắt.
Bước 5: Sau khi hút được Cercariae nhỏ lên lam, đậy lamen và tiễn hành kiểm tra dưới kính hiển vi, quan sát chuyên động và các đặc điềm hình thái Cercariae. Chụp hình Cercariae bằng phan mềm S — EYE tai vật kính 10.
Lưu ý: khi quan sát và chụp ảnh dùng giấy thấm đề thấm bớt nước làm hạn chế chuyên động của Cercariae. Ngoài ra nhỏ còn 70 độ va nước sôi 80 °C dé làm yếu và chết Cercariae dé Cercariae nằm cé định tại | vị trí dé chụp ảnh.
Tiên hành kiểm tra toàn bộ ốc thu được bằng phương pháp shedding, cốc nào không quan sát thấy thải Cercariae kiêm tra lại bằng phương pháp cat chóp ốc (crushing). Do trong cơ thé ốc cụ thé là tại gan, đã có một số Cercariae thoát khỏi Redia giai đoạn II sau khoảng 45 - 54 ngày kê từ ngày nhiễm trứng san lá (giai đoạn Miracidium) và tiếp tục sông trong cơ thé dc đến khi dat 55 - 62 ngày Cercariae mới thoát ra ngoài cơ thé Ốc và bơi tự do trong nước [11].
Phương pháp cắt chóp ốc (crushing)
Phương pháp nảy được sử dụng dé kiểm tra ốc chết trong quá trình nghiên cứu và toàn bộ ốc không phát hiện nhiễm ở phương pháp shedding theo Frandsen va Christensen (1984) và các bước tiền hành dựa theo hướng dẫn của Phan Thị Vân và
Bùi Ngọc Thanh (2013) [39], [38]:
Bước 1: Tham khô dc, dùng kém cắt bỏ một phần chóp đít ốc dốc lay dịch tiết ra ở đít ốc cho lên lam kính. Đôi với mẫu khô không lay được dịch tiết, nhỏ thêm 1 giọt nước vào miệng vết cắt rồi đốc lấy chất lỏng ở đít ốc cho lên lam kính.
Bước 2: Dùng nhíp gắp các mảnh vỏ và kim mũi mác gạc bỏ cặn vỏ ốc, đậy
lamen.
Lưu ý: Trong quá trình thao tác phải ngâm, lau dụng cụ (kém, nhip, kim mũi mác) bằng côn 70 độ tránh nhiễm chéo.
Bước 3: Quan sát trên kính hiển vi dé thấy được các giai đoạn au tring bén
trong ốc (gdm Redia, Sporocyst và Cercariae).
2.2.2.3. Phương pháp định danh nhóm Cercariae
Định danh các nhóm ấu trùng san lá song chủ (giai đoạn Cercariae) theo Phạm
Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê (2005), Frandsen va Christensen [40], [38].
2.2.2.4. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
142-925. . af số ốc nhiễm
- Ti lệ nhiém Cercariae trên 6c = ————— —-x 100
féng số ắc thu được
- Chỉ số đa dạng được tính theo công thức tính chỉ số đa dang của Simpspon
[41].
1- D =1- }[m(n-1)/N(N-DỊ
Trong đó:
- D là giá trị của chỉ số
- n¡ là số lượng cá thé của loài thứ i
- N là số lượng cá thẻ tong của khu vực
- Trong nghiên cứu này dùng 1-D như vậy 0<D<]
- Chỉ số đồng đều được tính theo công thức của Shannon (1949) [41].
jJ' =ằH'/InS
Trong đó:
- ]' là giá trị chỉ số
- § là tông số lượng loài trong khu vực
30
- H' là chỉ số đa dang của Shannon được tính theo công thức
*=ô }(pĂ x In pi)
pi là tỉ lệ số lượng cá thé thứ i so với tông số lượng cá thé
Tất cả các dit liệu thu thập được xử lý và phân tích bằng Microsoft Excel 2019 và xử lý tỉ lệ nhiễm theo mùa bằng phần mềm SPSS.