1. Quy trình tổng hợp điều chế chitine, chitosan, glucosamine hydrochloride, glucosamine sulfate, acetyl glucosamine
Vỏ tôm sạch
Ngâm trong HCl 10%, t = 12 giờ, T0 phòng
Rửa trung tính
Đun trong NaOH 3%, t = 3,5- 4 giờ, T = 90- 950C
Ngâm trong KMnO4 1%, sau đó trong C2H2O4 1%
Rửa sạch, sấy khô ở 600C
Chitine
Đun trong HCl 36%, t = 4 giờ, T0 = 90- 950 C
Ngâm trong NaOH 50%, t = 4 giờ, T 0 = 110- 1200C
Rửa trung tính
Chitosan Glucosamine hydrochloride
Kết tinh Tách kết tủa bằng iso propanol
Glucosamine sulfate
Hình 17 Quy trình điều chế chitine, chitosan, glu.HCl, glu.sulfate và Ac.glu từ vỏ tôm
Luận văn tốt nghiệp 36 SVTH: Nguyễn Ngọc Thái Trân 2. Điều chế chitine từ vỏ tôm
2.1 Quá trình loại protein
Tiến hành loại bỏ hoàn toàn protein bằng dung dịch NaOH 3%. Lượng NaOH 3% cho vào đến khi ngập toàn bộ vỏ tôm và kiểm tra pH = 11 - 12 là được để đảm bảo việc loại bỏ protein được hoàn toàn. Đun ở nhiệt độ 90 – 950C trong khoảng 3,5 - 4 giờ. Rửa sạch bằng nước thường và nước cất đến pH = 7.
Tiến trình thực hiện:
Cân 40g vỏ tôm khô cho vào bình cầu 500ml, sau đó cho dung dịch NaOH 3% vào cho đến khi ngập hoàn toàn vỏ tôm và kiểm tra pH= 11- 12 là đạt yêu cầu. Đun ở nhiệt độ 90 – 950C trong khoảng 3,5 - 4 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc đem sản phẩm đi rửa bằng nước thường đến pH=7, sau đó tráng lại bằng nước cất. Sản phẩm thu được có màu trắng phớt hồng.
2.2 Quá trình khử khoáng
Trong vỏ tôm, thành phần khoáng chủ yếu là muối CaCO3, MgCO3 và rất ít Ca3(PO4)2. Nên người ta thường dùng các loại acid như HCl,H2SO4… để khử khoáng. Khi khử khoáng, nếu dùng HCl thì cho hiệu quả cao hơn. Nếu dùng H2SO4 sẽ tạo muối khó tan nên ít sử dụng.
Phản ứng của HCl để khử khoáng như sau:
MgCO3 + 2HCl = MgCl2 + CO2 + H2O.
CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O.
Ca2(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4.
Sau khi khử khoáng tiến hành rửa trung tính, quá trình rửa kết thúc khi dịch rửa cho pH=7.
Vỏ tôm ngâm trong dd NaOH 3%
Dịch rửa NaOH
Vỏ tôm sau khi ngâm HCl Tiến trình thực hiện:
Vỏ tôm thu được cho vào cốc 1lít, sau đó cho từ từ 200ml HCl 10% vào và để ngập toàn bộ vỏ tôm, ngâm trong khoảng 12 giờ (để qua đêm) và để ở nhiệt độ phòng. Sau 12 giờ, vớt vỏ tôm ra và rửa lại bằng nước thường đến pH=7, sau đó rửa bằng nước cất.
Để chitine thu được trắng đẹp ta tiến hành tẩy màu chitine.
2.4 Tẩy màu chitine
Chitine thô thu được có màu hồng nhạt do còn sắc tố astaxanthin. Do chitine ổn định với các chất oxy hoá như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước javel (NaOCl+NaCl), Na2S2O3, CH3COCH3,…lợi dụng tính chất này ta sử dụng KMnO4, H2O2 để khử màu cho chitine.
Tiến hành tẩy màu chitine: Chất màu (astaxanthin) có trong chitine được loại bỏ bằng cách:
Cho 10ml dung dịch KMnO4 1% vào trong bình đựng chtine ở trên, sau đó trộn đều với nhau, để trong thời gian 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiếp theo ta ngâm trong 50ml acid Oxalic HOOC-COOH 1%, đun nóng ở nhiệt độ 50 – 600C thu được chitine trắng.
Chitine sau quá trình tẩy màu được rửa sạch bằng nước thường và được rửa lại với nước cất. Sấy khô ở nhiệt độ 600C, thu được chitine khô.
Chitine ngâm trong KMnO4 Chitine ngâm trong C2H2O4
Luận văn tốt nghiệp 38 SVTH: Nguyễn Ngọc Thái Trân Hiệu suất quá trình điều chế chitine được tính theo công thức sau:
Trong đó :
m1: số gam của vỏ tôm ban đầu (g).
m2: số gam chitine thu được (g).
H(%) : hiệu suất của quá trình (%).
Kết quả thu được như sau:
Bảng 2.3 Hàm lượng chitine trong vỏ tôm STT Vỏ tôm (g) Chitine (g) Hiệu suất (%)
1 40 12.4 31
2 40 12,28 30,7
3 40 13,23 33,08
3. Điều chế chitosan bằng cách deacetyl chitine Phương trình phản ứng điều chế chitosan từ chitine :
O CH2OH
OH
NHCOCH3
O O
n
nNaOH 50%
110 - 1200C
O CH2OH
OH
NH2
O O
n
+ nCH3COONa
Quá trình điều chế chitosan từ chitine thực chất là quá trình deacetyl hoá (deacetylation) chitine, chuyển hoá nhóm –NHCOCH3 thành nhóm –NH2 và loại bỏ nhóm acetyl –CH3CO, chuyển hoá thành muối natri (CH3COONa). Để thực hiện được quá trình deacetyl hoá hoàn toàn, sử dụng NaOH đậm đặc 50%, thời gian là 4 giờ với nhiệt độ ở 110 – 1200C. Kiểm tra sơ bộ mức độ chuyển hóa chitine thành chitosan bằng cách lấy một ít sản phẩm cho vào CH3COOH 1%, nếu sản phẩm tan tạo thành dung dịch keo trong suốt là được. Sau đó rửa trung tính và sấy khô, chitosan thu được có màu trắng sáng.
H% =
m1 m2
x 100 ( % )
Từ chitine điều chế trên, cân lượng chính xác 10g chitine cho vào bình cầu 500ml, sau đó cho 350ml dung dịch NaOH 50% cho đến ngập hoàn toàn chitine. Đun ở nhiệt độ 110 – 1200C, thỉnh thoảng có khuấy cho phản ứng xảy ra nhanh, thời gian đun là 4 giờ. Sản phẩm sau phản ứng được rửa sạch đến pH=7, rửa lại bằng nước cất, sấy khô.
Sản phẩm thu được là chitosan có màu trắng.
Hiệu suất quá trình điều chế chitosan được tính theo công thức:
Trong đó :
m1: khối lượng chitine tham gia phản ứng (g).
m2: khối lượng sản phẩm chitosan thu được (g).
H(%) : hiệu suất của quá trình (%).
Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.1 Hiệu suất điều chế chitosan từ chitine STT Chitine (g) Chitosan (g) Hiệu suất (%)
1 10 6,18 61,8
2 10 6,36 63,6
4. Điều chế glucosamine hydrochloride
4.1 Điều chế glucosamine hydrochloride từ chitine
Cân 5g chitine khô cho vào bình cầu 250ml, sau đó thêm 40ml HCl 36%. Đun cách thủy có lắp sinh hàn hồi lưu, khuấy đều và duy trì ở nhiệt độ khoảng 90 – 950C. Khi nhiệt độ hỗn hợp trong bình phản ứng đạt 65 – 700C thì chitine bắt đầu tan rất nhanh tạo thành dung dịch màu nâu đen. Đun trong thời gian 4giờ. Kết thúc thời gian phản ứng, sản phẩm được lọc nóng để loại bỏ cặn bẩn, sau đó dịch lọc được tẩy màu bằng 1g than hoạt tính, giai đoạn này hỗn hợp được đun nóng đến 900C, sau đó duy trì ở nhiệt độ 50 – 600C trong thời gian 30 phút.
H% =
m1 m2
x 100 ( % )
Luận văn tốt nghiệp 40 SVTH: Nguyễn Ngọc Thái Trân Lọc bỏ than hoạt tính thu được dung dịch có màu xanh nhạt trong suốt, để nguội thu được dung dịch có màu vàng rơm. Dung dịch để nguội lạnh ở nhiệt độ 0 – 40C, thời gian để kết tinh là 12 giờ (để qua đêm). Tinh thể glu.HCl được tách
ra bằng phương pháp lọc, sau đó rửa lại sản phẩm thu được bằng cồn 960. Sản phẩm được sấy khô ở nhiệt độ 600C thì thu được tinh thể glu.HCl khô trắng đẹp.
4.2 Tinh chế glu.HCl
Cân 2g glu.HCl cho vào bình cầu 100ml, thêm dần 25ml cồn 960, đun sôi, có khuấy ở nhiệt độ 75 – 800C. Sau khi hỗn hợp sôi, cho từ từ nước cất tối thiểu vào, cho đến khi glu.HCl tan hết (vẫn duy trì ở nhiệt độ sôi), lượng nước cất tối thiểu là 5,5 - 6ml cho 2g glu.HCl. Đun tiếp 60 phút, lọc nóng. Để kết tinh lại ở nhiệt độ 0 – 40C trong thời gian 4 giờ.
Tinh thể được lọc và rửa bằng cồn 960 (2 lần x 3ml), sấy khô ở nhiệt độ 600C thu được glu.HCl tinh khiết. Dung dịch nước cái đem cô bớt dung môi và kết tinh lại để thu thêm glu.HCl.
Hiệu suất của quá trình điều chế glu.HCl từ chitine được tính theo công thức sau:
Trong đó :
m1: khối lượng chitine ban đầu (g).
m2: khối lượng sản phẩm glu.HCl thu được (g).
H(%) : hiệu suất của quá trình (%).
Kết quả của quá trình thu được như sau:
Bảng 4.1 Hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitine STT Chitine (g) Glu.HCl (g) Hiệu suất (%)
1 5 2,93 58,6
2 5 2,88 57,6
3 5 3,02 60,4
H% =
m1 m2
x 100 ( % )
Glucosamine hydrochloride
Glucosamine hydrochloride có dạng tinh thể không màu, không mùi
Tan trong nước, tan ít trong methanol sôi, không tan trong ether và chloroform.
Đo nhiệt độ nóng chảy: cho glucosamine hydrochloride vào ống vi quản rồi tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy trên máy hiệu electrothermal.
Kết quả thu được sau khi tiến hành đo:
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Nhiệt độ nóng
chảy (0C) 188.5 188.8 188.7 188.67
Sắc ký bản mỏng:
- Bản mỏng 60F254 : 1 x 5cm
- Hệ dung môi: n-butanol: acid acetic: H2O (4 : 1 : 2,2) - Thuốc phun hiện màu: H2SO4 20%
Kết quả: cho một vệt màu vàng đậm. Rf = 0,378
5. Điều chế glucosamine sulfate potassium chlohydride
Cân 2,59g glu.HCl cho vào bình cầu 3 cổ 200ml có gắn hệ thống sinh hàn, một cổ được gắn nhiệt kế để xác định nhiệt độ trong bình, thêm vào bình cầu 8,4g nước tinh khiết, khuấy trộn liên tục cho đến khi thu được dung dịch trong suốt. Sau đó tiến hành cân 1,06g K2SO4 và
Kết quả TLC của glucosamine hydrochloride
Luận văn tốt nghiệp 42 SVTH: Nguyễn Ngọc Thái Trân được cho vào bình cầu, tiếp tục khuấy khoảng 1 giờ ở nhiệt độ 25- 300C . Sau khi phản ứng trao đổi ion trong bình cầu xảy ra hoàn toàn, cho vào dung dịch
sau phản ứng 33,6g dung dịch isopropanol để kết tủa glucosamine sulfate. Hỗn hợp phản ứng được duy trì ờ 200C trong 4 giờ và sản phẩm glucosamine sulfate được thu hồi bằng phương pháp lọc. Sau khi lọc sản phẩm được rửa sạch với 100g isopropanol và được sấy chân không ở 700C trong 8 giờ ta được tinh thể glucosamine sulfate trắng đẹp.
Hiệu suất của quá trình điều chế glu.sulfate được tính theo công thức sau:
Trong đó :
m1: khối lượng glucosamine sulfate thu được (g).
m2: khối lượng sản phẩm glucosamine.H2SO4 lý thuyết (g).
H(%) : hiệu suất của quá trình (%).
Kết quả của quá trình thu được như sau:
m1 = 0,35g glucosamine sulfate thực tế m2 = 0,37g glucosamine sulfate lý thuyết
H% =
m1 m2
x 100 ( % ) = 0,35 . 0,37
=
100 94,6%
Glucosamine sulfate có dạng tinh thể không màu, không mùi
Tan trong nước, ít tan trong methanol sôi, không tan trong ether và chloroform.
Đo nhiệt độ nóng chảy: cho glucosamine sulfate vào ống vi quản rồi tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy trên máy hiệu electrothermal.
Kết quả thu được sau khi tiến hành đo:
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Nhiệt độ nóng
chảy (0C) 206.7 207.1 206.5 206.76
H% =
m1 m2
x 100 ( % )
Glucosamine sulfate
Sắc ký bản mỏng:
- Bản mỏng 60F254 : 1 x 5cm
- Hệ dung môi: n-butanol: acid acetic: H2O (4 : 1 : 2,2) - Thuốc phun hiện màu: H2SO4 20%
Kết quả: cho một vết tròn màu vàng đậm. Rf = 0,378
6. Khảo sát tính chất hóa học của các dẫn xuất glucosamine
Cả 3 dẫn xuất của glucosamine đều cho hiện tượng giống nhau khi ta khảo sát từng tính chất hóa học sau:
6.1 Phản ứng tráng bạc
C5H12O4NCHO + 2[Ag(NH3)]OH C5H12O4NCOONH4 + 2Ag + 3NH3 +H2O
Glucosamine hydrochloride, glucosamine sulfate và acetyl glucosamine đều cho tráng bạc thu được kết quả rất rõ ràng
500 C
Kết quả TLC của glucosamine sulfate
Luận văn tốt nghiệp 44 SVTH: Nguyễn Ngọc Thái Trân 6.2 Phản ứng với Cu(OH)2
● Tạo phức màu xanh với Cu(OH)2 ở nhiệt độ thường:
Ta cho vào ống nghiệm 1 ít CuSO4 và NaOH để tạo tủa Cu(OH)2, sau đó thêm dung dịch glucosamine hydrochloride ta thu được phức màu xanh thẳm được hiển thị hình bên.
● Phản ứng với Cu(OH)2/OH– , đun nóng: tạo kết tủa Cu2O màu đỏ.
Phản ứng với Cu(OH)2 của nhóm CHO trên các dẫn xuất glucosamine tạo kết tủa đỏ cho kết quả rất rõ rệt.
CHO C C C C CH2OH
NH2 H OH OH H
HO
H H
CHO C C C C CH2OH
NH2 H H
HO
H
H O
O H
CHO C C C
H OH H
H2N
H C CH2OH
H O
O H
Cu
+ Cu(OH)2 + 2H2O
CHO C C C C CH2OH
NH2 H OH OH H
HO
H
H + 2 Cu(OH)2
+ 3H2O NaOH
t0 cao
COONa C C C C CH2OH
NH2 H OH OH H
HO
H
H + Cu2O
6.3 Phản ứng với benzaldehid C6H5CH=O:
Cho vào ống nghiệm một ít dung dịch benzadehid
C6H5CH=O, vài giọt H2SO4 với vai trò xúc tác, đun nóng, sau đó ta tiếp tục cho vào ống nghiệm dung dịch glu.HCl, nhóm NH2
trong phân tử glu.HCl tham gia phản ứng với C6H5CH=O tạo keo màu nâu
Phương trình phản ứng: