Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.2. Phương pháp xác định nguyên nhân gây bệnh
- Mô tả triệu chứng của vật gây bệnh, đặc điểm của rễ bị bệnh
Chụp ảnh và quan sát bằng mắt thường mô tả các Biểu hiện bên ngoài như: màu sắc lá, tình trạnh thân, rễ.
Lấy mẫu rễ quan sát trên kính soi nổi, mô tả các triệu chứng như: thối, loét…(nếu có)
- Phân lập trực tiếp từ rễ:
Chọn những rễ con có cả phần khỏe và phần bị bệnh, rửa bằng nước vô trùng nhiều lần, nhúng qua các rễ con trong cồn 70%, rửa nhanh và hơ khô trên đèn cồn. Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt rễ thành từng miếng dài 1-2mm ở phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh sau đó cấy lên môi trường PDA và môi trường trường CMA (Corn Meal Agar) có kháng sinh NARPH ((Nilstat 1ml;
Ampicillin 0.1g; Rifadin 0.5ml; Terraclor (PCNB) 0.1g; Hymexazol 0.05g))/lít). [40], [41].
Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 25oC và quan sát hàng ngày dưới kính lúp soi nổi để kiểm tra nấm mọc từ các miếng rễ cây.
Cấy truyền từng tản nấm lên môi trường PDA hoặc môi trường CMA.
Làm thuần nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm.
- Phương pháp bẫy đất:
Đây là phương pháp chọn lọc bởi vì nó thích hợp cho việc phân lập các loài sản sinh ra du động bào tử.
+ Cho khoảng 200g đất vào một hộp nhựa
+ Đổ nước vô trùng hoặc nước cất vào hộp đựng sao cho ngập đất khoảng 5-10cm.
+ Để lắng và vớt sạch rác nổi trên bề mặt nước
+ Thả vào hộp nhựa những lá non, tươi của cây trồng mẫn cảm với các bệnh, các vật liệu bẫy này sẽ nổi trên mặt nước (Hình 2-1).
+ Đặt cốc nguyên vị trí trong vòng 2-4 ngày.
+ Phân lập nấm sau 1-3 ngày từ mép vết bệnh đã phát triển trên vật liệu bẫy
sau khi rửa trong nước vô trùng và khử trùng bề mặt, dùng môi trường NARPH để phân lập. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 25oC, cấy truyền từng tản nấm lên môi trường PDA hoặc môi trường CMA. Làm thuần nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm.
Vật liệu có thể dùng để bẫy bao gồm lá cà ổi, lá cây có múi, lá đỗ quyên, lá keo....
Hình 2-1: Bẫy đất - Giám định loài nấm gây bệnh
Dựa vào đặc điểm hình thái, giải phẫu của bào tử áo (Chlamydospore), bào tử noãn (Oogonia) và túi bào tử động (Sporangia), định loại nấm dựa trên hai khóa phân loại nấm thuộc 2 chi Phytophthora và Pythium sau: chuyên khảo về Phytophthora của Hamm B.P. and Hansen M.E. (1987).[47]; chuyên khảo về Chi Pythium” của Plaats-Niterink A. J. van der (1981)[57].
Định loại nấm gây bệnh cũng được thực hiện dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử, cụ thể như sau:
- Tách chiết AND: Nghiền mẫu: mẫu nấm đựng trong ống ependoff 2,0ml, cho 1 thìa hạt thủy tinh và lắc trong máy lắc từ 1 dến 2 phút; cho vào bột mẫu vừa nghiền 400l dung dịch AP1; cho tiếp 4 l RnaseA và lắc đều trên máy
votex; ủ nóng dung dịch mẫu ở 650C trong 10 phút; thêm vào dung dịch mẫu dung dịch đệm 130l AP2; ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 5 phút; lấy 400
l dung dịch mẫu sang ống ependoff mới; thêm 1,5 thể tích dung dụng đệm AP3 vào ống chứa 400 l dung dịch mẫu (600 l dung dịch AP3); lấy 650 l dung dịch mẫu vào cột lọc DNeasy Mini Spin Column, ly tâm ở 8000 vòng phút trong 1 phút, đổ bỏ dung dịch chảy qua màng lọc, lấy tiếp dung dịch mẫu còn lại vào cột lọc DNeasy Mini Spin Column, ly tâm ở 8000 vòng phút trong 1 phút; đặt cột lọc DNeasy Mini Spin Column vào ống ly tâm mới và lấy 500l dung dịch đệm AW đổ trên cột lọc để rửa ADN và ly tâm ở 8000 vòng phút trong 1 phút, đổ bỏ dung dịch chảy qua màng lọc; thêm 500l dung dịch vào cột lọc để tiếp tục rửa ADN trên màng lọc, ly tâm ở 14000 vòng phút trong 2 phút, ADN nằm trên màng lọc của cột lọc DNeasy Mini Spin Column;
chuyển cột lọc sang ống ependoff mới, ghi ký hiệu mẫu và dùng 50 l dung dịch đệm AE đổ vào cột lọc DNeasy Mini Spin Column, ly tâm ở 8000 vòng phút trong 1 phút; thu ADN đã chảy từ cột lọc vào ống ependoff.
- Quy trình PCR: Hóa chất và công thức cho PCR đối với 1 ống ependoff nhỏ: nước không ion (14l), 10x EX Taq buffer (2l), dNTP mix (2l), primer 1- ITS1 10M (0,5l), primer 2-ITS4 10M (0,5l), EX taq (0,1l).
Tất cả các hóa chất trên được lấy 1 lượng gấp 9 lần cho vào 1 ống ependoff với tổng số 172l gồm các thành phần sau: nước (126l), 10x EX Taq buffer (18l), dNTP mix (18l), primer 1 (ITS1) (4,5 l) ), primer 2 (ITS4) (4,5 l), EX taq (1l). Lấy 19 l từ ống ependoff chứa 172 l cho vào 8 ống ependoff. Thêm 1 l ADN cần thực hiện phản ứng PCR của từng mẫu vào từng ống. Đánh số 1 đến 8. Ống ependoff từ 1 đến 7 chứa ADN còn ống thứ 8 là đối chứng. Chạy phản ứng PCR trên máy với quy trình: bước 1: cycle 1 (1x)ở 950C trong 03.00 phút; bước 2: cycle 1 (40x) ở 950C trong 00.30phút;
bước 2: ở 500C trong 00.30 phút; bước 3: ở 720C trong 01.00 phút; bước 1:
Cycle 3 (1x) ở 720C trong 05.00 phút; bước 1: cycle 1 (1x) ở 150C trong 10.00 phút.
- Quy trình chạy điện di: pha bản thạch: bản thạch 1% Agarose S (1 gam Agarose S + 99 ml TAE), đun chảy thạch, để nguội 500C đổ trên bản khuôn đã cắm lược; để nguội thạch, rút lược và đặt khay thạch vào máy điện di đã đổ dung dịch ATE, chiều lỗ lược quay về phía cực âm, cho 2l dung dịch đánh dấu vào lỗ lược 1. ADN của các mẫu được lấy 1.5 l trộn vói 1 l chất nhuộm cho vào các lỗ lược, lỗ lược thứ 8 là đối chứng không có DNA; chạy chương trình 22 phút ở 100V, nhúng trong dung dịch dịnh hình và quan sát ADN trên bản thạch dưới ánh sáng tử ngoại, những mẫu có ADN đủ lớn để sequencing phải thể thiện trên bản gel.
- Đọc trình tự AND và định loại các chủng nấm: Trình tự AND được đọc bằng phương pháp “Dideoxy Chain Termination”. Sử dụng máy đọc trình tự model 377 của hãng Applied Biosystem. Sữa chữa chuỗi AND bằng phần mền BioEdit. Các chuỗi AND của các mẫu nấm được so sánh với chuỗi AND trên ngân hàng gen thông qua giao diện tìm kiếm Blast (Basic Local Alignment Search Tool) trên website: http://ncbi.nlm.nih.gov.