Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh và tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh

1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thế giới

Trong vài thập kỷ qua đã có nhiều thành tựu trong tìm kiếm các loài xạ khuẩn và các hợp chất mới có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn trong mô tế bào thực vật. Đáng chú ý, hầu hết mỗi loại thực vật đều là nơi cư trú của rất nhiều vi sinh vật nội sinh tạo nên sự đa dạng sinh học. Tuy nhiên, mới chỉ có một phần nhỏ thực vậtđã được nghiên cứu và tìm kiếm các thể nội sinh, nên cơ hội để tìm ra các loài mới và sản phẩm có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tự nhiên còn rất lớn. Do tiềm năng ứng dụng lớn của xạ khuẩn nội sinh nên đối tượng vi sinh vật này đang được quan tâm và nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới [26, 48, 49, 50, 51, 52].

Sơ lược về tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thực vật trong hơn 10 năm gần đây được thể hiện trong bảng 1.1.

Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật

Xạ khuẩn nội sinh Cây chủ Tác động Tác giả

Streptomyces Đậu tương Thu nhận các vi lượng (Fe, Mo) và chất kháng khuẩn.

[53]

Streptomyces spp, Nocardia spp, Mycobacterium sp, Microbispora..

Lúa mì - Chất kháng khuẩn - Tăng trưởng thực vật

[18, 20]

Streptomyces, Microbispora, Micromonospora, Nocardiodes …

Aquilaria crassna Quýt

Sinh tổng hợp IAA [35, 43]

Streptomyces, Saccharopolyspora, Micromonospora, Actinopolyspora..

Lô hội, bạc hà, hương nhu tía

- Hòa tan phosphat - Sinh indole-3 axit axetic (IAA), hydroxamate - Tạo ra catechol.

[24]

Streptomyses spp EN27 và

Micromonospora sp EN43

Arabidopsi s thaliana

- Tăng sức đề kháng - Đối kháng vsv gây bệnh - Giảm stress cho cây chủ

[19]

Streptomyces, Nocardioides spp, Pseudonocardia…

Cây thuốc Kháng nấm [34]

Streptomyces sp Cây Ngô [21]

Streptomyces sp Cây chuối Kháng nấm Fusarium [17]

Xạ khuẩn Sâm Kích thích sinh tổng hợp

ginsenosides

[25]

Xạ khuẩn Thuốc lá Kháng nấm [27]

Hiện nay, xạ khuẩn nội sinh được phân lập từ nhiều loài cây trồng như lúa mì, gạo, khoai tây, cà rốt, cà chua, cây gỗ, nho, rêu và dương xỉ … [26, 38, 39] và chi được phân lập nhiều nhất thuộc chi Streptomyces, chúng thường cư trú trong rễ, thân và lá của cây, mà nhiều nhất trong rễ. Loài Streptomyces, loài Microbispora là hai loài thường xuyên nhất phân lập được từ mô thực vật. Inderiati và Muliani (2008) báo cáo rằng phần lớn các xạ khuẩn nội sinh thu nhận từ cây thuốc lá đã được phân loại là loài Streptomyces [27].

Tương tự như vậy, Sardi và cộng sự (1992) báo cáo rằng 482 trong 499 chủng phân lập từ

một loạt các thực vật là Streptomyces sp [41]. Hơn nữa, Verma và cộng sự (2009) nghiên cứu cho thấy Streptomyces sp. chiếm khoảng 50 % trong 55 chủng riêng biệt lấy từ cây tử

đinh hương Ấn Độ [55]. Tan và cộng sự (2006) đã phân lập được 619 chủng xạ khuẩn từ

các loại cây cà chua khác nhau và tất cả các chủng đó đều thuộc chi Streptomyces [52]. Từ

36 cây dược liệu ở Thái Lan, nhóm nghiên cứu của Taechowisan đã phân lập được 330 chủng xạ khuẩn thuộc 4 chi khác nhau (Streptomyces, Microbispora, Nocardia, Micromonospora) [48]. Hơn nữa Verma và cộng sự (2009) cho thấy Streptomyces sp. có chiếm khoảng 50 % trong tổng số 55 chủng thu nhận từ cây sầu đâu (Azadirachta indica A.Juss) tại Ấn Độ [55]. Tổng hợp các nghiên cứu trên cho thấy Streptomyces sp. có khả năng thích ứng, phát triển mạnh hơn so với xạ khuẩn thuộc chi khác. Điều thú vị là, phần lớn các loài Streptomyces nội sinh thường xuyên phân lập được từ nhiều nước khác nhau là

các loài S. aureus, S. galilaeus, S. caviscabies, S. setonii, S. cyaneus và S.

thermocarboxydus điều này cho thấy các loài này có thể có một khả năng tương thích cao với một loạt các thực vật so với các loài khác. Bên cạnh chi Streptomyces, nhiều chủng xạ khuẩn nội sinh thuộc chi Microbispora cũng đã được phân lập. Trong nghiên cứu của De Arau'jo et al. (2000), trong tổng số 53 xạ khuẩn nội sinh phân lập từ ngô thì có tới 33 là

Microbispora spp. và chỉ 6 là Streptomyces spp[21]. Theo Lee và cộng sự (2008), chi Microbispora spp. (67 %) là phổ biến nhất trên bắp cải Trung Quốc, tiếp theo là

Streptomyces spp. (12 %) và Micromonospora spp. (11 %) [31]. Takahashi và Omura (2003) phân lập được 33 chủng Microbispora, 32 Streptomyces và 10 xạ khuẩn hiếm khác từ lá rụng trong chín chi thực vật bậc cao [51]. Như vậy, các chi Streptomyces và

Microbispora có thể sinh sống được trong cả đất và nội sinh thực vật, mặc dù chỉ có một số lượng hạn chế của các loài có thể có sinh sống theo hai cách này. Lưu ý rằng Microbispora spp. được phân lập thường xuyên hơn từ lá cây hơn từ đất. El-Tarabily và

cộng sự (2006) ước tính mật độ xạ khuẩn nuôi cấy được trong dưa chuột (Cucummis sativus) và rễ của cây họ đậu (Glycine max) đạt 105 CFU/g khối lượng củ/rễ tươi [22]. So với thân và lá, tập hợp các chủng xạ khuẩn phân loại từ rễ nhìn chung đa dạng hơn. Cho đến nay, hơn 40 loài xạ khuẩn mới đã được tìm thấy bằng nhiều phương pháp phân lập và

phân loại khác nhau, bao gồm 4 chi mới thuộc nhóm Plantactinospora, Actinophytocola, Phytohabitans và Jishengella [38, 39].

1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật nội sinh trong nước

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh mới chỉ dừng lại ở một số nấm và

vi khuẩn nội sinh. Tuy nhiên, những nghiên cứu này mới chỉ là các phát hiện bước đầu và

ở quy mô thí nghiệm. Nghiên cứu của Nguyễn Sỹ Giao (1971) về ứng dụng một số chủng nấm cộng sinh trong nuôi trồng cây non phục vụ cho nghề trồng rừng, quy mô nghiên cứu

dừng lại ở bầu cây ươm [10]. Các nghiên cứu của Lê Thị Xuân, Lê Mai Hương (1997) [6]

về thăm dò khả năng tạo chất taxol từ cây thông đỏ ở Việt Nam, các tác giả này đã tách được từ lớp lõi của cây thông đỏ chủng nấm Mucor circinolloides var. tieghem và tách chiết được một chất gần giống với 10-deacetil baceatin III ở cây chủ. Lê Mai Hương và

cộng sự (2005) [5] cũng đã phân lập được chủng nấm nội sinh Aspergillus awamori Nakazawa trên cây sảng Sterculia lanceolata Cav và trên cây thuốc tại một số vùng trong nước, đồng thời nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của chủng nấm nội sinh nói trên. Bên cạnh nấm về vi khuẩn, Cao Ngọc Điệp và Phan Thị Nhã (2011) [2] đã nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trên cây Khóm trên đất phèn Đồng Bằng sông Cửu Long, đã phân lập được 45 dòng vi khuẩn nội sinh có ba đặc tính tốt như cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA. Trong đó, hai dòng vi khuẩn có ba đặc tính tốt nhất có độ tương đồng cao với dòng vi khuẩn Burkholderia tropica đã được thử nghiệm vào sản suất phân bón sinh học cho cây chủ. Trong một nghiên cứu khác, Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp (2011) [7] đã phân lập được 37 dòng vi khuẩn nội sinh trên cây cúc xuyên chi, qua phân loại cho thấy các dòng vi khuẩn chủ yếu là Bacillus sp và Acinetobacter antiviralis. Theo Nguyễn Văn Minh và cộng sự (2014) [14] đã sàng lọc được 21 chủng vi khuẩn nội sinh và 14 chủng vi nấm nội sinh trên cây cao su từ Thành phố Hồ Chí Minh, tỉnh Bình Phước và tỉnh Bình Dương. Trong đó chủng Bacillus thuringiensis T9 và T6 có khả năng kiểm soát sinh học nấm Corynespora cassiicola gây bệnh rụng lá cao su. Hiện nay, hướng nghiên cứu về các chủng xạ khuẩn nội sinh trong nước chưa nhiều đặc biệt là xạ khuẩn nội sinh trên cây có múi.

1.2.2. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh a. Sinh chất kháng sinh

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật có khả năng hình thành nhiều loại CKS sử dụng trong y học. Có đến 80 % chủng xạ khuẩn phân lập được tiết CKS có giá trị trong y học, trong đó 1/3 các CKS là do xạ khuẩn hiếm sinh ra [13].

Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng, ức chế ung thư từ xạ khuẩn nội sinh đang là hướng nghiên cứu mới của các nhà khoa học trên thế giới.

Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội sinh có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây chủ. Một số giả thuyết nhận định rằng gen liên quan tới tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học được tiếp nhận từ quá trình trao đổi chất giữa VSV và thực vật thông qua hệ thống chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT). Nhờ đó các nhà VSV học đã mở ra triển vọng sản xuất các hợp chất sinh học có nguồn gốc từ thực vật nhờ quá trình nuôi cấy

VSV. Ví dụ như chất kháng ung thư paclitaxel phổ biến trên cây thông đỏ được tách chiết từ xạ khuẩn Kitasatopora sp. và một số nấm cộng sinh khác.

Một số nghiên cứ gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh mới trên xạ khuẩn nội sinh có tỷ lệ khá cao so với xạ khuẩn phân lập từ đất mới trên xạ khuẩn nội sinh có tỷ lệ khá cao so với xạ khuẩn phân lập từ đất hoặc bề mặt thực vật. Chẳng hạn kháng sinh mới có tên naphthomycin K (dẫn xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) được phát hiện lần đầu tiên từ Streptomyces sp. CS nội cộng sinh trong cây mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) - loại cây thuốc có tác dụng điều trị ung thư. Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây độc ức chế dòng tế bào p388 và A - 549 ở nồng độ ức chế lần lượt là 0,07 và 3,17 àM, nhưng khụng cú hoạt tính kháng Staphylococcus và vi khuẩn lao.

Ngoài năm chất mới thuộc phân lớp 16 của nhóm macrolides được tách chiết và cho kết quả ức chế mạnh dòng tế bào MDA - MB - 435 trong điều kiện in vitro, hai chất mới thuộc nhóm macrolides thu nhận từ Streptomyces sp. 131 gần đây được phân lập trên cây mỹ đăng mộc (M. hookeri), trong đó hợp chất dimeric dinactin có tác động kháng ung thư mạnh và hoạt tính kháng nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cao.

Trước đây, hai hợp chất 5,7 - dimetoxy - 4 - phenylcoumari và 5,7 -dimetoxy - 4 - p - methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng ung thư mạnh, thường thu nhận từ nhiều loại cây thực vật khác nhau. Nhưng gần đây, nhiều công trình công bố rằng hai hợp chất này cũng được tìm thấy trong S. aureofaciens CMUAc130 nội cộng sinh. Hoạt tính kháng ung thư của hai chất trên không chỉ hình thành nhóm nitric oxide, prostaglandin E2 và tác nhân hoại tử khối u (TNF - α), mà còn cảm ứng nitric oxide synthase và cyclooxygenase - 2 trong lipopolysaccharide gây đại thực bào tế bào RAW 264,7. Tác dụng ức chế phụ thuộc vào nồng độ chất và ức chế sự hình thành TNF – α[48, 49].

b. Ứng dụng trong kiểm soát sinh học và kích thích tăng trưởng thực vật

Khi đã ổn định trong cây, vi sinh vật nội sinh có thể tác động tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của cây một cách trực tiếp (kích thích sinh trưởng) hoặc thông qua kiểm soát bệnh dịch. Vi sinh vật nội sinh trực tiếp kích thích sinh trưởng nhờ cung cấp dinh dưỡng cho cây, hay sinh tổng hợp hoặc điều hòa các phytohormone, đặc biệt là IAA.

Nhiều chủng vi sinh vật nội sinh sinh tổng hợp IAA (indole-3- acetic acid đồng thời cũng có khả năng giảm lượng ethylene trong cây nhờ enzyme (1-aminocyclopropane-1- carboxylate)-deaminase. Điều này rất có ý nghĩa, bởi nồng độ ethylene cao khi cây bị stress làm ức chế quá trình phát triển của bộ rễ. Ngoài ra, vi sinh vật nội sinh còn có khả

năng sinh tổng hợp các phytohormone khác như abscisic acid (ABA), cytokinin và

gibberellin (GBs) [33].

Khả năng kiểm soát bệnh dịch của vi sinh vật nội sinh dựa trên một số cơ chế như đối kháng (antibiosis) giúp cây chủ hạn chế bệnh bằng cách chúng sinh ra các chất kháng khuẩn [34], các enzyme phân hủy thành tế bào của nấm bệnh [43], cạnh tranh về dinh dưỡng và nơi cư trú, và kích thích tính chống chịu hệ thống của cây chủ [33].

Sự khu trú của vi sinh vật nội sinh trong cây chủ có thể gây ra một số biến đổi của thành tế bào như tích tụ callose, pectin, cellulose và các hợp chất có phenol, dẫn tới hình thành một hàng rào cấu trúc tại vị trí bị tác nhân gây bệnh tấn công. Ngoài ra, cây có vi sinh vật nội sinh khi bị tác nhân gây bệnh tấn công thường có phản ứng là tăng cường sinh tổng hợp các protein phòng vệ như peroxidase, chitinase và β-1,3-glucanase, có tác dụng ngăn chặn sự lan truyền của mầm bệnh. Hơn nữa, nhiều loài vi sinh vật nội sinh thưòng thể hiện kết hợp nhiều cơ chế kháng bệnh, vì một số hợp chất kháng tác nhân gây bệnh cũng đồng thời kích thích đáp ứng miễn dịch hệ thống [35]. Ngoài ra, xạ khuẩn nội sinh có vai trò quan trọng trong sự phát triển của cây chủ, do chúng có thể ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây bằng con đường đồng hóa các chất dinh dưỡng (ví dụ, sự tương hỗ về thu nhận các vi lượng như Fe hoặc Mo hòa tan trong đất cố định nitơ tự do ) [53].Một số tác giả chứng minh khả năng bảo vệ thực vật chủ chống lại các tác nhân gây bệnh từ đất như Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Penicillium digitatum, Fusarium oxysporum, Penicillium pinophilum, Phytophthora dresclea và Colletotrichum fulcatum[17, 24]. Gangwar và cộng sự (2014) đã phân lập từ các cây lô hội, bạc hà, hương nhu tía được 12 chủng xạ khuẩn nội sinh có khả năng hòa tan phosphat, 16 chủng sản xuất indole-3 axit axetic (IAA), 9 chủng được sản xuất hydroxamate và 4 chủng có thể tạo ra catechol[24]. Chúng thực sự là các ứng cử viên cho nghiên cứu kiểm soát sinh học nông nghiệp trong tương lai.