Phương pháp nghiên cứu

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ các mô sống của các mẫu thực vật Các mẫu thực vật từ cây cam được lấy và lưu giữ trong túi nilon riêng rẽ. Mỗi mẫu cây được chia thành 3 phần riêng: Rễ, cành, lá đựng trong túi nilon sạch có ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu. Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi xử lí và phân tích trong vòng 7 ngày.

Phương pháp tiến hành: Mẫu rễ, cành hoặc lá được rửa sạch bề mặt. Sau đó, mẫu lá

được cắt thành các mẩu nhỏ (kích thước 1 x 1 cm), mẫu cành hoặc rễ được cắt thành các đoạn dài 1 cm. Các mẫu đã cắt được ngâm ngập trong dung dịch 5 % sodium hypochlorite (NaOCl) trong 1 phút, tiếp đó được xử lý với cồn 70 % trong 5 phút rồi được rửa bằng nước cất khử trùng 5 lần. Các mẫu thực vật sạch này được giã nhỏ và bổ sung vào đĩa môi trường khoáng humic, có chứa chất kháng nấm (nystatin 100 mg/lít) và chất kháng khuẩn nalidixic acid (10 mg/lít). Các đĩa thạch được nuôi ở 30oC và phân lập các chủng xạ khuẩn xuất hiện trên môi trường sau 15 ÷ 60 ngày. Các mẫu xạ khuẩn này được thuần khiết và

giữ trên môi trường ISP2 và sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.

2.2.2. Đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn

Khả năng sinh chất kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn phân lập dựa trên khả năng đối kháng của các chủng này với một số chủng nấm bệnh trên cây có múi (Colletotrichum truncatum VSVD 14,Geotrichum candidum VSVĐ 5, Fusarium oxysporum FO5 và Fusarium udum VSVĐ 2) và một số vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) kiểm định bằng phương pháp cục thạch và phương pháp khuếch tán trên thạch.

Kiểm tra khả năng đối kháng do cạnh tranh nguồn dinh dưỡng

Thí nghiệm được tiến hành song song bằng cách chuyển nấm bệnh được nuôi trên môi trường PDA từ đĩa giống sang 1 đĩa môi trường PDA mới, nấm được đặt cách vị trí xạ

khuẩn là 3cm ; mẫu thí nghiệm đối chứng được nuôi ủ và theo dõi. Khả năng ức chế nấm được tính toán theo công thức: AB = B – A. Trong đó AB là hoạt động ức chế sự phát triển của nấm, A = khoảng cách của nấm tới khuẩn lạc của xạ khuẩn. B = đường kính phát triển của nấm trên môi trường đối chứng. Tỷ lệ AB sẽ được đánh giá như sau: < 1mm: không có ức chế; 1 ÷ 9mm (+); 10 ÷ 19mm (++); >20mm (+++) [32].

Sản xuất các chất kháng khuẩn và kháng nấm: Xạ khuẩn được nuôi trên các môi trường kiểm tra lỏng ở 30°C, 150 vòng/phút trong 4 ngày. Ly tâm thu 5ml dịch, bổ sung 5ml ethylacetate. Hỗn dịch được huyền phù hóa trong 45 phút, sau đó ly tâm thu dịch trong ở 12000 vòng/phút, 10 phút. Dịch sau ly tâm cho bay hơi trong một giờ và thu phần dịch còn lại. Phần dịch (5ml) bổ sung 5ml ethyl acetat và cho bay hơi trong 30 phút. Đối chứng âm dịch sau lên men được thay bằng nước cất [28].

Hoạt tính kháng nấm được thử bằng phương pháp khuếch tán trên thạch.

2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

Nghiên cứu đặc điểm sinh họctheo phương pháp trong ISP (1974) và khóa phân loại Bergey. Màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC), khuẩn ty khí sinh (KTKS), sắc tố melanin và sắc tố tan tiết ra môi trường được đánh giá theo Shirling và Gottlieb (1966) trên bảng màu của Tresner và Backus. Căn cứ vào màu sắc hệ sợi khí sinh của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh...

[44,54].

Hình dạng cuống sinh bào tử và cấu trúc bề mặt bào tử của xạ khuẩn nghiên cứu được quan sát dưới kính hiển kính hiển vi điện tử quét JSM-5000 tại Viện Vật liệu, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay hơi lượn sóng ký hiệu là RF (Rectiflexibiles), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Retinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spirales). Bề mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: nhẵn ký hiệu là Sm (Smooth), dạng mụn cóc ký hiệu là Wa (Warty), dạng gai ký hiệu là Sp (Spiny) và dạng tóc ký hiệu là Ha (Hairy) [36].

Sự hình thành sắc tố melanin: Sắc tố melanin được kiểm tra trên môi trường ISP1, ISP6 và ISP7 sau 7 ÷ 14 và 21 ngày nuôi cấy. Nếu sinh melanin, màu sắc tố xung quanh khuẩn lạc xạ khuẩn trên môi trường nuôi sẽ chuyển từ màu vàng nâu sang màu đỏ đậm cho đến màu đen [36].

Khả năng sử dụng các nguồn cacbon: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP 9 có bổ sung thêm 1% các nguồn đường tương ứng: Glucose, Arabinose, Sucrose, Manitol, Xylose, Fructose, Cellulose, Rafinose, Rhamnose. Kiểm tra sinh trưởng sau 7 ÷ 14 ngày ở

nhiệt độ 28 ÷ 30oC. Môi trường có glucosa được coi là đối chứng dương, môi trường không đường được coi là đối chứng âm [36].

Xác định nhiệt độ tối ưu: Chủng được nuôi trên môi trường thạch Bennet ở nhiệt độ 10; 15; 22; 28; 30; 35; 37; 40; 45; 50; 55 và 60oC. Sau 7 ÷ 14 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng.

Xác định pH tối ưu: Xạ khuẩn nuôi cấy trên môi trường dịch thể Bennet đã chỉnh pH từ

2 ÷ 12. Nuôi lắc 200 vòng/phút ở 28ºC. Sau 5 ÷ 7 ngày thu dịch và tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút ở nhiệt độ 4C trong 10 phút, thu sinh khối để từ đó xác định khả năng sinh trưởng.

Khả năng chịu NaCl: Môi trường ISP 2 dịch thể có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ: 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 và 7,0 (%). Nuôi lắc xạ khuẩn 200 vòng/phút ở 28ºC. Sau 7 ngày thu dịch và tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút ở nhiệt độ 4C trong 10 phút, thu sinh khối và

xác định khả năng sinh trưởng.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa ISP 2. Sau khi phát triển tốt, dùng que cấy vô trùng cấy chấm điểm lên các đĩa Petri chứa môi trường Gauze 1 có bổ sung các cơ chất đặc hiệu: tinh bột để xác định hoạt tính amylase, casein để xác định hoạt tính protease, chitin để xác định hoạt tính chitinase, CMC (Cacboxyl Methyl Cellulose) để xác định hoạt tính xenlulase. Sau 5 ngày nuôi ở 28ºC, xác định khả năng sinh tổng hợp các amylase bằng thuốc thử Lugol, protease bằng thuốc thử tricloacetic, chitinase bằng congo đỏ 0,5%. Khả năng sinh enzym được xác định bằng giá trị D-d (mm), trong đó D là đường kính vòng thủy phân cơ chất, d là đường kính khuẩn lạc.

2.2.4. Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA

DNA tổng số của chủng C12 được tách chiết theo phương pháp của Sambrook &

Russell (2001) [40].Gen mã hóa 16S rRNA của chủng xạ khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi 27F (5'-TAACACATGCAAGTCGAACG-3') và

1492R (5'-GG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3') theo chu trình nhiệt: 94oC trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 60oC trong 60 giây, 72oC trong 90 giây), 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC. Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tích trên máy đọc trình tự ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, xử lý bằng phần mềm SeqAssem version 01/2005 và

Sequencher version 4.0.5. Mức độ tương đồng của gen 16S rDNA của các chủng vi khuẩn được so sánh với các trình tự gen 16S rDNA. Mức độ tương đồng di truyền của các chủng được xây dựng dựa trên phần mềm ClustalX 2.0.11.

2.2.5. Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh

Tách chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ. Hoạt chất kháng nấm do xạ khuẩn sinh tổng hợp có thể nằm trong sinh khối hay trong dịch nuôi cấy. Vì vậy để

tách chiết kháng sinh thì cầnlựa chọn dung môi thích hợp cho từng phương pháp tách chiết.

Tách chiết kháng sinh từ sinh khối

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường lên men thích hợp trên máy lắc 150v/p ở nhiệt độ 28 ÷ 30oC , sau 120 giờ thu hồi dịch lên men, ly tâm ở 5000 v/p trong 15 phút, loại dịch, thu sinh khối. Rửa sinh khối với nước cất đã khử trùng để loại bỏ các thành phần môi trường bám quanh sinh khối. Cân 3g sinh khối + 30ml dịch dung môi, lắc trên máy lắc 150 v/p. Sau 24 giờ ly tâm, thu dịch chiết. Thử hoạt tính kháng nấm theo phương pháp khoanh giấy lọc.

Tách chiết kháng sinh từ dịch nuôi cấy

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường lên men thích hợp trên máy lắc 150v/p ở nhiệt độ 28 ÷ 30oC , sau 120 giờ thu hồi dịch lên men, ly tâm ở 5000 v/p trong 15 phút, loại sinh khối, thu dịch lọc.Chia dịch thành 4 phần. Chỉnh dịch về 3 pH: 3, 7 và 10 và đối chứng không chỉnh pH. Bổ sung dung môi vào dịch lọc theo tỷ lệ 1:1 lắc trên máy lắc 150 v/p ở 28oC. Sau 24 giờ để lắng, ly tâm thu lấy dịch chiết. Thử hoạt tính kháng nấm theo phương pháp khoanh giấy lọc.

Tinh sạch kháng sinh

Dịch chiết kháng sinh từ sinh khối hay dịch nuôi cấy được cho bay hơi dung môi đến khi còn khoảng 1/5 so với lượng dịch ban đầu. Để dịch chiết sau bay hơi ở 4oC, 24 giờ xuất hiện kết tủa. Ly tâm lạnh ở 4oC, 12000 v/p trong 5 phút, tách riêng dịch và tủa. Làm khô tủa thu được kháng sinh thô dạng bột.

Quy trình tinh sạch kháng sinh thô

- Chuẩn bị cột tách: Cột có đường khính 2cm, chiều dài 30cm. Chất nhồi (pha tĩnh ) silicagel 0,04 ÷ 0,06 mm của Tay Ban Nha. Nhồi cột bằng kỹ thuật nhồi cột khô, cùng bơm nén và để một ngày cho ổn định cột.Chiều dài của pha tĩnh là khoảng 20cm.

- Chuẩn bị chất cần tách

Cân khoảng 0,5g hỗn hợp chất cần tách hoà tan trong 20ml methanol, cân 1g silicagel cho vào dung dịch, cô đuổi dung môi trên nồi cách thuỷ chân không đến khô thu được mẫu bột silicagel hấp phụ các chất cần tách.

- Chuẩn bị pha động để rửa giải

Pha động là hỗn hợp dung môi n-hexan – chloroform – methanol tỷ lệ tương ứng về thể tích 7:4:2, được trộn đều đồng nhất.

- Quy trình tinh sạch

Đưa mẫu silicagel hấp phụ chất lên cột, dung pha động để rửa giải các chất, dung dịch ra khỏi cột được thu vào ống 10ml (gọi là 1 phân đoạn), thu lấy 44 phân đoạn như vậy, kiểm tra bằng bản mỏng xác định phân đoạn từ 28 đến 44 chỉ có một chấm tròn sắc nét có cùng hệ số Rf trên UV 366nm cũng như axit sunfuric đặc đun nóng, từ đó kết luận phân đoạn 28 ÷ 44 là một chất sạch, gộp các phân đoạn này với nhau và để bay hơi tự

nhiên thu được tinh thể chất rắn. Chất rắn sạch này được đo phổ hấp thu phân tử UV – VIS, phổ hồng ngoại (Infrared (IR) spectroscopy).

2.2.6. Phương pháp xác định một số tính chất của chất kháng nấm và kháng khuẩn

* Xác định khả năng bền trong pH của chất kháng sinh

Xử lý dịch kháng sinh thô ở các pHkhác nhau: pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 và 9 bằng NaOH 0,5M và CH3COOH 0,4M và giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Sau đó chỉnh các mức pH trên về pH 7 rồi tiến hành thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch.

* Xác định khả năng bền với nhiệt độ của chất kháng sinh

Xử lý dịch kháng sinh thô ở các nhiệt độ khác nhau 40oC, 70oC, 80oC và100oC kéo dài 30, 60, 90 và 120 phút, sau đó để nguội và xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch.

Phần III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN