Mẫu quả mướp đắng được thu tại Thái Bình vào tháng 6 năm 2011 và được TS. Bùi Văn Thanh,Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học là M. charantia L., quả mướp đắng có màu xanh nhạt, gai tù và ít đắng. Mẫu tiêu bản lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hình 2.1. Mẫu M. charantia L. thu hái tại Thái Bình 2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất Sắc ký lớp mỏng (TLC)
21
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.
Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất; sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp.
Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và chất hấp phụ pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Chất hấp phụ pha đảo RP-18 (150 m, FuJisilisa Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:
Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): được đo trên hệ Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS, Đại học Yonsei, Hàn Quốc
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Bruker AVANCE 500, Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan).
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC và HMBC.
22
Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: CD3OD.
Điểm nóng chảy (mp): Điểm nóng chảy được đo trên máy Thermo scientific Mel-Temp 3.0 của Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Độ quay cực: Độ quay cực đo trên máy Jasco P-2000 Polarimeter của Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase Sàng lọc sơ bộ tìm mẫu (chất) có hoạt tính
Bước 1: Mẫu thử được pha trong DMSO rồi pha loãng ở các nồng độ thích hợp trong đệm phosphate (0,1 M, pH 6,9).
Bước 2: 50 àl mẫu thử được ủ với 100 àl dung dịch 0,5 àg/mL enzyme α- glucosidase trong đệm phosphate (0,1 M, pH 6,9) ở nhiệt độ 37oC trong 10 phút.
Bước 3: Thờm 50 àL dung dịch 5 mM pNPG trong đệm phosphate vào hỗn hợp trên.
Bước 4: Hỗn hợp phản ứng được ủ tiếp ở nhiệt độ 37oC trong 5 phút Bước 5: Đo hỗn hợp trên bằng máy ELISA ở bước sóng 405 nm.
Chất chuẩn dương (positive control) acarbose được dùng để kiểm soát độ ổn định và đánh giá hoạt tính ức chế tương đương. Các phép thử được lặp lại 3 lần.
Kết quả được tính theo công thức sau:
% Ức chế = 100
OD - OD
) OD - (OD - ) OD - (OD
- c + c
b s -
c
c+ x
Trong đó:
ODc+: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu thử, có α-glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 0%);
ODc-: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng âm (không có mẫu thử và α-glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%);
23 ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử;
ODb: Mật độ quang trung bình mẫu trắng (có mẫu thử, không có α- glucosidase).
Tìm nồng độ ức chế 50% (IC50) của mẫu (chất) có hoạt tính:
Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng dựa trên 5 nồng độ thử nghiệm.
Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy phi tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 5.0.
24