1.3. Tổng quan về thiết kế maker
1.3.2. Thiết kế marker dựa trên BlastDigester
Phần mềm BlastDigester cho phép thiết kế các marker CAPS bằng 3 bước đơn giản (hình 01).
Bước 1: Chọn lựa các trình tự mã hóa hoặc không mã hóa, vùng không lặp lại từ 2 trình tự đã được sắp cột thẳng hàng bằng BLAST. Việc chọn lựa phục thuộc vào mức độ đa hình giữa hai trình tự. Có thể dùng thuật toán BLASTN hoặc BAST2SEQ. Lưu ý là khi sử dụng BLAST chạy trên trang web cần chọn tùy chọn đầu ra của BLAST dưới dạng BLAST, mặc dù chép trực tiếp từ đầu ra của Blast2Seq từ NCBI cũng có thể được BlastDigester chấp nhận.
Bước 2: Đầu ra của BLAST ở dạng text có thể được chuyển toàn bộ vào trang web BlastDigester. Các thông số cơ bản của primers như Tm, hàm lượng GC content, kích thước primer và khoảng kích thước các sản phẩm khuếch đại.
Thông thường BlastDigester sẽ cài đặt sẵn sản phẩm PCR ở 400–1000 bp (điều này giúp quá trình phân tích bằng gel agarose về sau được thuận tiện hơn). Ngoài ra, người dùng cũng cần lưu ý cài đặt thông số gọi là quãng loại trừ (exclusion interval) ở khoảng 50 bp. Khi đó các enzyme cắt hạn chế SNP (tức các SNP bị thay đổi vị trí nhận diện điểm cắt hạn chế khi cắt ngẫu nhiên nơi nào đó trong trình tự bên trong quãng loại trừ) sẽ đánh dấu mầu xám ở kết quả quả đầu ra.
18
Bước 3: Đầu ra của BlastDigester là các SNP được tìm thấy. BlastDigester đến số lượng các enzyme SNP tiềm năng cắt đâu đó trong đó trong trình tự và thể hiện thông tin này ở cả hai dạng bảng và dạng trình tự. Do đó enzyme cắt ít trình tự hoặc điểm cắt duy nhất sẽ được chọn. Thêm nữa, nếu các enzyme SNP cắt bên trong quãng giới hạn đã được định nghĩa trước đó, nó cũng được đánh dấu màu xám. Nếu không, các SNP tiềm năng sẽ được đánh dấu màu đỏ và nối lien kết với Primer3. Khi đó chỉ việc bấm chọn để chuyển thông tin SNP vào Primer3 để thiết kế mồi. Sau khi chuyển dữ liệu qua Primer3, primer CAPS sẽ được Primer3 xuất ra ở cửa sổ tương ứng.
Đầu vào của BlastDigester là các trình tự đã được sắp cột thẳng hàng cục bộ, có thể lấy từ đầu ra của Blast hoặc Blast2Seq. Ở đầu ra của Blast có 2 phần (1) một bảng thể hiện danh sách các điểm cắt hạn chế cho cả hai trình tự; (2) Trình tự đã sắp cột thẳng hàng với vị trí các điểm cắt giới hạn chính xác (hình 1b). Bằng cách chọn vị trí giới hạn đa hình, BlastDigester sẽ kích hoạt và kích hoạt chương trình Primer3, khi đó các primers bao phủ 1 vị trí SNP đặc hiệu sẽ được tự động tạo ra (hình 1C). Các thông số cơ bản để thiết kế primers có thể được cài đặt ở đầu vào của BlastDigester (ví dụ Tm của mồi, thành phần GC, kích thước primers và kích thước sản phẩm dự kiến, hình 1a). Để tạo ra các mảnh có kích thước khác nhau vừa phải giữa các marker ứng viên, một cửa sổ phụ sẽ giúp xác định các thông số loại trừ: ví dụ nếu ezyme cắt giới hạn cũng cắt phạm vào “vùng cấm”, thì ở đầu ra nó sẽ được bôi màu xám, nhờ thế loại bỏ bới các marker CAPS không hoàn hảo. Trong trường hợp hai trình tự có tỷ lệ đa hình cao, BlastDigester sẽ can thiệp vào Primer3 đối với các vùng không có các mismatch.
19
Hình 1.1. Các bước tạo marker CAPS với BlastDigester.
(a) Bước 1: Tại đầu vào của BlastDigester nhập kết quả đầu ra của BLAST và những thông tin cần thiết cho Primer3
(b) Bước 2: Chọn thông tin cần thiết trong BlastDigester.
(c) Thông tin được chuyển thẳng sang Primer3 tại đó sẽ tạo ra primer tối ưu cho PCR.
(d) Một ví dụ gel agarose là kết quả của 10 primers CAPS được thiết kế dựa trên kết quả sắp cột thẳng hàng của BLAST. Hình trên và dưới chỉ ra sản phẩm PCR
20
trước và sau thực hiện phản ứng phân cắt giới hạn. Enzyme sử dụng để phân cắt được chỉ định giữa hai hình ảnh, Các làn ở góc phải chứa DNA ladder và màu đỏ chỉ 1kb.
Nhập số lượng các điểm không bắt cặp trùng khớp mong muốn: Ví dụ: muốn sử dụng CAPS, nhập vào “0”. Sau đó, dữ liệu đầu ra sẽ hiển thị việc có hay không
vị trí nhận cắt của enzyme cắt giới hạn trong trình tự đang khảo sát.
21
- Xuất dữ liệu: Chương trình này tìm kiếm đối với bất kỳ vị trí nhận biết để hoạt động cũa enzyme cắt giới hạn dựa trên bốn trường hợp trình tự, vốn là hai trình tự đang khảo sát và hai trình tự bổ sung ngược của các trình tự đang khảo sát. Trong trường hợp “0” các điểm bắt cặp không trùng khớp, chương trình chỉ cung cấp vị trí nhận biết để hoạt động của enzymes cắt giới hạn mà không có thông tin về mồi. Trong trường hợp này, cần thiết kế một cặp mồi để khuếch đại trình tự xác đáng chứa trình tự nhận biết để cắt giới hạn mục tiêu bằng các chương trình thiết kế mồi khác như Primer3.
22
- Trong trường hợp không thể tìm thấy vị trí nhận biết để cắt giới hạn của enzyme trong vùng đang khảo sát, có thể thử dCAPs. Nhập “1” vào số lượng không bắt cặp trùng khớp, chương trình sẽ chỉ ra các dCAPs.
Chương trình này cũng tìm lần lượt các trình tự xuôi và ngược bổ sung của 2 trình tự được khảo sát nhằm tìm vị trí nhận biết để hoạt động của enzyme cắt giới hạn.
23
Dữ liệu xuất ra sẽ biểu diễn các vị trí nhận biết hữu hiệu để hoạt động của các enzyme cắt giới hạn trong các trình tự được khảo sát và các trình tự mồi khả dĩ đối với mỗi điểm bắt cặp không trùng khớp. Các trình tự được hiển thị bằng chữ có màu chỉ ra các điểm bắt cặp không trùng khớp. Kết quả xuất ra cung cấp trình tự mồi để đưa vào tạo và khuếch đại các đoạn nucleotide mang vị trí nhận biết để hoạt động của enzyme cắt giới hạn. Mồi cho các mạch khác cần phải được thiết kế một cách riêng rẽ.