3.4. Phương pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi
3.4.4. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi khuẩn S. suis
a. Chuẩn bị
- Dụng cụ, thiết bị: Kính hiển vi, que cấy đầu tròn, đèn cồn, diêm, phiến kính, chậu rửa, bình xịt nước cất và các dụng cụ cần thiết.
- Vật liệu, hoá chất:
+ Vi khuẩn S. suis
+ Dung dịch tím tinh thể (Crystal violet) + Dung dịch đỏ Fucshin
+ Cồn Axeton + Dung dịch Lugol + Nước cất
35
b. Các bước tiến hành
- Bước 1: Làm vết bôi và cố định tiêu bản
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống thạch nghiêng (hoặc dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
Cố định vết bôi bằng cách hơ thật nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính.
- Bước 2: Nhuộm màu
+ Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước.
+ Nhuộm thêm dung dịch Lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước.
+ Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước.
+ Nhuộm tiếp bằng dung dịch fuchsin trong 1 phút, rửa nước, để khô.
- Bước 3: Quan sát dưới kính hiển vi điện tử ở vật kính dầu 40x để quan sát đặc tính bắt mầu của vi khuẩn S. suis.
- Kết quả: Vi khuẩn S. suis là vi khuẩn Gram (+), bắt màu tím.
3.4.4.2. Thử phản ứng Oxydase
- Nguyên tắc: Phát hiện khả năng sinh enzyme Cytochrome oxydase của vi khuẩn S. suis.
- Tiến hành: Tiến hành trên giấy được thấm 1% dung dịch Tetrametyl - p - Phenylenediamine hydrochloride. Dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên trên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Nếu thấy xuất hiện màu tím đen sau 30 giây là phản ứng dương tính. Nếu không thấy xuất hiện màu tím đen hoặc không đổi màu là phản ứng âm tính.
- Kết quả: S. suis cho phan ứng Oxydase âm tính.
3.4.4.3. Thử phản ứng Catalase
- Nguyên tắc: Phát hiện men Catalase chuyển hóa năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy tiện.
36
- Tiến hành: Dùng phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2
3%) lên trên, que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch trộn đều với giọt H2O2 3%, nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính.
3.4.4.4. Thử phản ứng sinh Indol
- Nguyên tắc: Phát hiện các vi sinh vật có enzym Tryptophanase chuyển hóa trypton tạo thành Indol (do Indol kết hợp với p - dimethylaminobenzal dehyde trong thuốc thử Kovacs).
- Tiến hành: Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường nước thịt.
Để tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ. Nhỏ 0,5 ml dung dịch Kovac’s vào, lắc nhẹ.
Phản ứng dương tính khi quan sát thấy màu hồng ở lớp trên cùng.
- Kết quả: S. Suis cho phản ứng Indol âm tính.
3.4.4.5. Thử phản ứng lên men đường
- Tiến hành: Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường nước thịt, nuôi ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ, sau đó nhỏ 0,2 ml canh khuẩn vào môi trường pepton cho thêm 1% một trong các loại đường Trehalose, Salicin, Mannitol và chỉ thị đỏ Phenol. Sau 24 giờ giữ ở tủ ấm 37oC, nếu quan sát thấy màu của môi trường thay đổi thành mầu đỏ là dương tính, nếu môi trường không chuyển màu là âm tính.
- Kết quả: S. suis dương tính với các loại đường Trehalose, Salicin và âm tính với đường Mannitol.
3.4.4.6. Kiểm tra khả năng dung huyết
- Quan sát khả năng làm tan huyết xung quanh khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần kiểm tra sau khi đã nuôi cấy trên đĩa thạch máu thỏ, ủ ở tủ ấm 37oC (5% CO2) qua 24 giờ.
+ Dung huyết kiểu α: vùng dung huyết xung quanh khuẩn lạc thường có màu xanh (dung huyết từng phần hay dung huyết không hoàn toàn)
37
+ Dung huyết kiểu β: bao quanh khuẩn lạc là một vùng tan máu hoàn toàn trong suốt, có bờ rõ ràng do Hemoglobin bị phân huỷ hoàn toàn.
+ Dung huyết kiểu γ (hay còn gọi là không dung huyết): không làm biến đổi thạch máu.
- Kết quả: vi khuẩn S. suis gây dung huyết kiểu α.
3.4.4.7. Kiểm tra khả năng phát triển trong môi trường NaCl 6.5%
- Tiên hành: Chủng vi khuẩn cần kiểm tra được cấy vào môi trường NaCl 6.5%. Sau khi ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ, nếu quan sát mà không thấy môi trường có hiện tượng đục là phản ứng âm tính.
- Kết quả: Vi khuẩn S. suis không phát triển trong môi trường NaCl 6.5%
(phản ứng âm tính).
3.4.4.8.Phản ứng Voges Proskauer (VP)
- Nguyên tắc: Phát hiện các vi khuẩn có 2 loại enzym chuyển hóa 2, 3 Butanol thành Acetoin khi không có oxy và chuyển hóa tiếp Acetoin thành Diacetyl (Diacetyl kết hợp với Guanidin trong pepton tạo thành phức Diacetyl- Guanidin có màu đỏ.)
- Cách tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường VP, đặt ở nhiệt độ 37oC trong 24 - 48 giờ. Sau đó nhỏ 5 giọt dung dịch Alpha naphtol 6% (trong cồn 90%) và 5 giọt NaOH 16% (trong nước), lắc nhẹ. Nếu dịch thể chuyển sang màu đỏ nâu là phản ứng dương tính, màu vàng nhạt là âm tính.
- Kết quả: Vi khuẩn S. suis cho phản ứng âm tính.