Các bước thực hiện nhân in vitro

1.4. Phương pháp nhân in vitro

1.4.1. Các bước thực hiện nhân in vitro

Bước 1: Chọn cây mẹ phải sạch bệnh, sạch virus.

Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu

Đây là giai đoạn khử trùng vào mẫu, giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, mục đích nuôi cấy, vị trí lấy mẫu. Khi nuôi cấy cần chọn đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa cuối cùng là đoạn thân mảnh lá. Đồng thời cũng phải chọn đúng phương pháp khử trùng và hóa chất khử trùng.

Bước 3: Giai đoạn nhân nhanh

Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số nhân lớn. Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra từ một chồi ban đầu. Để có được hệ số nhân lớn thì phải tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy, môi trường, chất dinh dưỡng và hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng đặc biệt là cytokinin. [3]

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Kết thúc giai đoạn nhân nhanh tạo ra một số lượng chồi lớn, những chồi này được chuyển tiếp sang giai đoạn hoàn chỉnh, tạo rễ với môi trường có bổ sung auxin.

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỉ lệ cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo các yếu tố sau:

15

- Cây phải có hình thái thích hợp (chiều cao, đủ thân, lá, rễ,...).

- Cho cây làm quen với môi trường trước khi đưa ra trồng.

- Đưa cây vào giá thể thích hợp giúp cây sinh trưởng tốt.[1],[2]

1.4.2. Các ƣu nhƣợc điểm Ưu điểm:

- Phương pháp có khả năng hình thành cây giống từ một mô, cơ quan rất nhỏ, trong khi các phương pháp nhân giống truyền thống phải sử dụng đến cả một bộ phận sinh dưỡng.

- Phương pháp này cho hệ số nhân cho một lượng giống nhiều trong khoảng thời gian ngắn.

- Phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh nên có thể tiến hành quanh năm.

- Có thể chủ động điều chỉnh được các yếu tố, tác nhân nhiệt độ, ánh sáng.

- Phương pháp được tiến hành trong điều kiện vô trùng nên có thể tạo được giống hoàn toàn sạch bệnh.

- Từ một vật liệu nhiễm virus có khả năng tạo và nhân hàng loạt cây sạch virus.

- Cây giống in vitro nếu chưa sử dụng thì có thể bảo quản trong thời gian dài bằng điều kiện in vitro.

Nhược điểm:

Tuy phương pháp này có rất nhiều ưu điểm nhưng nó cũng có một số nhược điểm sau:

- Mặc dù phương pháp này có hệ số nhân cao nhưng kích thước cây rất nhỏ, đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn.

- Cây được nhân trong điều kiện tối ưu về dinh dưỡng, độ ẩm, ánh sáng... nên khi đưa ra môi trường cây khó thích nghi, dễ bị mất nước và chết.

16

- Phương pháp yêu cầu đòi hỏi đầu tư trang thiết bị cao, nguồn lực có kỹ thuật.

- Những vấn đề còn tồn tại trong vi nhân giống: tính bất định về mặt di truyền, sự nhiễm mẫu, việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy, hiện tượng thủy tinh hóa.

- Chuyển cây từ môi trường in vitro ra tự nhiên thường gặp khó khăn

Để khắc phục một số nhược điểm của nhân giống in vitro như tỉ lệ cây non khi chuyển ra môi trường tự nhiên bị chết nhiều thì chúng tôi đã ứng dụng hệ thống khí canh điều kiện thích nghi trước khi chuyển ra đất.

1.4.3. Các nghiên cứu về in vitro cây sắn trên thế giới

Theo nghiên cứu về vi nhân bằng kỹ thuật in vitro sắn bằng nuôi cấy mô chi phí thấp [13],công nghệ nuôi cấy mô có thể được sử dụng để tạo ra cây giống có chất lượng cao thay vì sử dụng theo cách truyền thống. Nó có thể tạo ra hàng ngàn cây không giống như các kỹ thuật thông thường. Công nghệ nuôi cấy mô thực vật đã được sử dụng rộng rãi để nhân rộng sắn trên khắp thế giới. Điều này là bởi vì nó là phương pháp tốt nhất để sản xuất vật liệu trồng sắn. Một số giống sắn không có hoa và sản lượng hạt thấp làm ảnh hưởng tới việc nhân giống [14]. Do đó, cây sắn được nhân lên chủ yếu bằng sinh sản sinh dưỡng là sử dụng các thân cây vụ trước làm giống cho vụ sau [15]. Những hộ nông dân sản suất quy mô nhỏ nhận vật liệu trồng từ các vùng bệnh, rồi đem trồng ở các vùng khác dần dần làm lây lan và phát tán các loại bệnh [16],[17]. Điều này làm cho việc nuôi cấy mô là một công nghệ quan trọng trong việc thiết lập hệ thống giống sắn. Nuôi cấy mô đã được áp dụng có hiệu quả trong việc loại bỏ virus và các bệnh. Cây in vitro sắn cho phép trao đổi và bảo tồn các vật liệu nhân giống [18]. Tuy nhiên, chi phí sản xuất cây in vitro là một trở ngại cho việc tiếp cận nông dân. Do đó, cần có những nỗ lực để phát triển các công nghệ chi phí thấp [19]. Nghiên cứu này đã tìm cách thiết lập một quy trình hiệu quả về chi phí cho việc nhân giống bằng sắn sử dụng các vật liệu sẵn có tại địa phương.

17

Một nghiên cứu khác về tối ưu hóa việc nhân giống các giống sắn khác nhau (Manihot esculenta Crantz) [20] có chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống sắn của Ethiopia. Sắn là một loại cây nhân vô tính và khả năng nhân giống của nó nói chung là mất nhiều thời gian và chậm [21]. Những giống có những đặc tính như khả năng sinh trưởng và chi phí phân phối cao, tỉ lệ nhân thấp và nguồn hom giống khó bảo quản [22]. Các kỹ thuật in vitro đã được sử dụng để tạo ra các giống năng suất cao, các vật liệu trồng không kháng bệnh và kháng bệnh, ngay cả từ các cây mẹ bị nhiễm bệnh [23]. Việc sản xuất một giống cây mà sẽ giữ được các đặc tính phân biệt khi nuôi cấy với cùng một loại vật liệu trồng cây cũng có thể đạt được thông qua việc nhân giống trong ống nghiệm. Phương pháp nhân giống này có thể được thực hiện bất kể mùa vụ nào, cho phép sự sẵn có của vật liệu trồng trọt quanh năm và do đó đảm bảo sự mở rộng sản xuất. Nuôi cấy mô đã được khai thác để nhân nhanh, chuyển đổi và bảo tồn sắn với sản lượng cao hơn. Tuy nhiên, cần phải phát triển mô hình có chi phí thấp hoặc tối ưu hóa sản xuất in vitro.

Nghiên cứu về các giống sắn ở Ethiopia [24] có chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng đến 2 giống sắn phổ biến ở quốc gia này. Mặc dù các nghiên cứu khác nhau đã được thực hiện về nuôi cấy tế bào sắn [25], [28], [26] có rất ít công việc đã được thực hiện trên các yếu tố ảnh hưởng đến việc nhân vi mao sắn. Hơn nữa, chỉ có một báo cáo về vi nhân giống của hai giống đã được công bố ('Kello' và 'Qulle') ở Ethiopia [27]. Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này là đánh giá nảy mầm của hai giống ở nhiệt độ khác nhau trong nhà kính và để điều tra các yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến nhân chúng trong ống nghiệm.

Hai giống 'Kello' và 'Qulle' nhận từ Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Hawassa, Phòng Nghiên cứu Cây có củ. Mục tiêu của nghiên cứu này là tìm ra các điều kiện tối ưu cho vi nhân giống của hai giống sắn được chuyển giao cho nông dân để sản xuất các vật liệu trồng chất lượng cao. Các nghiên cứu này bao gồm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên chồi của cây mẹ, sự khác biệt về nồng độ muối,

18

sucrose và thidiazuron trong môi trường MS bán cứng, pH, môi trường MS hai lần và nuôi cấy lặp đi lặp lại. Số lượng chồi nách trung bình trên mỗi cây là cao nhất (10,8) ở 26°C đối với Kello và 9,8 ở 30°C đối với 'Qulle'. Số lượng chồi trung bình cao nhất được trên môi trường MS chứa 0,2 mg/l thidiazuron cho cả hai giống trên cả hệ thống nuôi cấy vừa giữa bán cứng và hai bước. Số chồi trung bình lớn nhất đạt được trên môi trường MS 1/4 cho 'Kello' và 'Qulle' tương ứng. Số lượng chồi nách trung bình trên mỗi cây cho 'Kello' (4.10) và 'Qulle' (2.40) đã đạt được ở pH 5.6 và 6.6 tương ứng. 'Kello' phát sinh 3,70 chồi/mẫu trên môi trường MS chứa 1,5% sucrose. Việc tái các nuôi cấy của 'Qulle' dẫn đến việc mất dần tỷ lệ nhân từ lần thứ ba trở lên.

1.4.4. Các nghiên cứu về in vitro cây sắn ở Việt Nam

Trong nghiên cứu mới nhất về nghiên cứu hệ thống tái sinh cây sắn (Manihot esculenta Crantz.) thông qua phôi soma từ lá chưa trưởng thành [29] có nói rằng các hệ thống tái sinh cây sắn thông qua quá trình tạo phôi soma đã được cải tiến [31]. Đối với bất cứ quá trình vi nhân giống nào, giai đoạn sinh trưởng cũng quyết định hiệu suất của quá trình. Các thùy lá non ( lá chưa trưởng thành) được cảm ứng bởi 2,4- D và NAA để tạo phôi [32], [30]. Thay vì được cảm ứng bằng 2,4-D, mô phân sinh đỉnh và thùy lá chưa trưởng thành được cảm ứng tạo phôi soma sơ cấp bởi picloram [33], [34]. Các mảnh lá mầm màu xanh được tách từ phôi giai đoạn lá mầm được đặt lên môi trường P-CIM để cảm ứng phôi soma thứ cấp. Cách cấy chuyển phôi soma đối với phát sinh phôi thứ cấp ảnh hưởng tới hình thái của mô phát sinh phôi [35]. Các phôi soma thứ cấp được chuyển sang môi trường bổ sung NAA hoặc BA để phôi trưởng thành [30], hoặc có thể bổ sung thêm AgNO3 vào môi trường đã có BA nhằm kéo dài chồi.

Nghiên cứu này nhằm mục đích tái sinh cây sắn (Manihot esculenta Crantz.) thông qua phôi soma từ lá chưa trưởng thành. Vật liệu được sử dụng là các mảnh lá chưa trưởng thành của các cây in vitro từ 2-3 tuần tuổi. Phôi soma được cảm ứng

19

tạo thành trên môi trường MS có bổ sung picloram với các nồng độ khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy, trên môi trường MS bổ sung 12 mg/l picloram, cả hai giống đều cho tỉ lệ hình thành phôi soma cao nhất. Sau 4 tuần, giống KM94 cho tỷ lệ hình thành phôi cao hơn 11,4% so với giống KM140. Tuy nhiên, khi cụm phôi được chuyển sang môi trường MS có bổ sung 0,3 mg/l BAP để nảy mầm tạo cây con, tỷ lệ tạo cây con ở giống KM140 lại cao hơn với giống KM 94. Chồi cây được tạo ra đạt chiều dài khoảng 1,0 - 1,5 cm được chuyển sang môi trường MS không có chất kích thích sinh trưởng cho tỷ lệ ra rễ đạt 100%, rễ sinh trưởng tốt nhất.

Những cây tái sinh in vitro có bộ rễ hoàn chỉnh được trồng trong bầu giá thể trấu hun: đất cát (4: 6) đạt tỷ lệ cây sống 100%. Quy trình tạo cây non hoàn chỉnh trong 16 - 18 tuần là cơ sở quan trọng cho xây dựng quy trình chuyển gene ở cây sắn.

Theo nghiên cứu của Vũ Văn Kiên và Nguyễn Du Sang (2011) [36] về việc cải tiến các giống hiện có cho mục đích tăng năng suất, tăng hàm lượng protein và giảm acid cyanhydric. Điều kiện quan trọng cho quy trình cải tiến giống thông qua các kỹ thuật hiện đại như chuyển gen, dung hợp tế bào, đột biến lý học cần một hệ thống tái sinh cây hoàn chỉnh [37]. Trong những năm gần đây, bộ môn Sinh lý Thực vật, Trường đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành một số nghiên cứu trên cây khoai mì như: ghép giữa mì cao su và khoai mì, tạo mô sẹo và dịch treo tế bào, phát sinh chồi, phát sinh hình thái phôi thể hệ từ mô sẹo có nguồn gốc lá khoai mì dòng Cuống Trầu.

Phôi thế hệ ở khoai mì dòng KM297 từ khúc cắt thùy lá non in vitro hay khúc cắt lá mầm phôi thể hệ được cảm ứng trên môi trường MS bổ sung picloram 8mg/l, sau 13 ngày nuôi cấy trong tối. Các giai đoạn noãn phát triển phôi được ghi nhận sau 10 ngày nuôi cấy ở ngoài sáng trên môi trường MS bổ sung BA 0,1mg/l và NAA 0,01mg/l. Hoạt tính AIA và Zeatin nội sinh của giai đoạn noãn phôi hình cầu đã được phân tích.