PHẦN 2: BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 2: PHÂN TÍCH ACID AMINE BẰNG SỰ CHUYỂN HÓA PITC
II. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO – HPLC
2.3. Cỏc ủại lượng ủặc trưng của sắc ký ủồ
Hỡnh 22: Cỏc ủại lượng ủặc trưng của sắc ký ủồ
Kết quả của quỏ trỡnh tỏch cỏc chất ủược detector phỏt hiện ghi thành sắc ký ủồ như hình trên.
Từ cỏc thụng số của cỏc peak trờn ủõy, nhiều ủại lượng ủặc trưng về lý thuyết ủược ủưa ra ủể dỏnh giỏ một quỏ trỡnh sắc ký .Dưới ủõy là một số ủại lượng thường dựng trong thực tế và cỏch thay ủổi cỏc ủại lượng này cú lợi cho quỏ trỡnh phõn tớch sắc ký.
2.3.1. Thời gian lưu thực t’r (Retention time):
Thời gian lưu của một chất là thời gian tớnh từ khi bơm mẫu vào cột cho ủến khi chất ủú ra khỏi cột ủạt giỏ trị cực ủại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng ủịnh và cỏc chất khỏc nhau thỡ thời gian lưu sẽ khỏc nhau trờn cựng một ủiều kiện sắc ký ủó chọn.Vỡ vậy thời gian lưu là ủại lượng ủể phỏt hiện ủịnh tớnh cỏc chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
− Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
− Bản chất, thành phần, tốc ủộ của pha ủộng
− Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
− Trong một số trường hợp thời gian lưu cũn phụ thuộc vào pH của pha ủộng
Trong một phép phân tích nếu tr nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tr quá lớn thì peak bị gión và ủộ lặp lại của peak rất kộm, thời gian phõn tớch rất dài ủồng thời kộo theo nhiều vấn ủề khỏc như hao tốn dung mụi, hoỏ chất, ủộ chớnh xỏc của phộp phõn tớch kộm. ðể thay ủổi thời gian lưu chỳng ta dựa vào cỏc yếu tố trờn ủó trỡnh bày.
2.3.2. Hệ số dung lượng K’(Capacity Factor):
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phõn bố của chất ủú trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha ủộng ở trong thời ủiểm cõn bằng.
0 ' 0
t t K tR −
= (15)
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì peak bị giãn. Trong thực tế K’ từ 1 – 5 là tối ưu.
2.3.3. ðộ chọn lọc:
ðộ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi 2 chất A, B có KA' và
'
KB khỏc nhau thỡ mới cú khả năng tỏch, mức ủộ tỏch biểu thị ở ủộ chọn lọc '
'
A B
K
= K Với ủiều kiện KB' >KA' tức là ủộ chọn lọc càng khỏc 1 thỡ khả năng tỏch càng rừ ràng.
Hỡnh 23: Lựa chọn giỏ trị ủộ chọn lọc
2.3.4. Số ủĩa lý thuyết N:
Số ủĩa lý thuyết là ủại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một ủiều kiện sắc ký nhất ủịnh. Mỗi ủĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh cú chiều cao là H, tất nhiờn lớp này cú tớnh chất ủộng tức là một khu vực của hệ phõn tỏch mà trong ủú một cõn bằng nhiệt ủộng học ủược thiết lập giữa nồỡng ủộ trung bỡnh của chất tan trong pha tĩnh và pha ủộng.
Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
− ðường kớnh và ủộ hấp phụ của hạt pha tĩnh.
− Tốc ủộ và ủộ nhớt (ủộ phõn cực) của pha ủộng
− Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột.
Vỡ vậy với một ủiều kiờn sắc ký xỏc ủịnh thỡ chiều cao H cũng hằng ủịnh ủối với một chất phân tích.
Số ủĩa lý thuyết N ủược tớnh theo cụng thức sau:
2
54 .
5
×
= W
N tR (16)
Trong ủú:
tR: thời gian lưu của chất phân tích .
W0.5: ủộ rộng tại ủiểm 1/2 của peak. Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 ủến 5500 là vừa ủủ.
2.3.5. ðộ phân giải R (Resolution ):
ðộ phõn giải là ủại lượng biểu thị ủộ tỏch của cỏc chất ra khỏi nhau trờn một ủiều kiện sắc ký ủó cho. ðộ phõn giải của 2 peak cạnh nhau phải ủược tớnh theo cụng thức sau:
B A
RA RB
W W
t R t
+
× −
=
' '
2 (17)
Trong thực tế nếu cỏc peak cõn ủối (Gauss) thỡ ủộ phõn giải tối thiểu ủể 2 peak tỏch là R =1.0 .Trong phộp ủịnh lượng R = 1.5 là phự hợp.
− Nếu R nhỏ thì các peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích peak sẽ không chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo 3 cách sau:
Làm thay ủổi K’ bằng cỏch thay ủổi lực rửa giải của pha ủộng (thay ủổi ủộ phõn cực nếu là RP – HPLC, thay ủổi cường ủộ ion nếu là IE – HPLC ...)
Làm tăng ủộ chọn lọc bằng cỏch dựng cột khỏc phự hợp hơn với quỏ trỡnh tỏch hoặc thay ủổi thành phần pha ủộng.
− Nếu R lớn quỏ thỡ thời gian phõn tớch sẽ lõu, tốn nhiều pha ủộng, ủộ nhạy sẽ kộm.
ðể khắc phục ta cú thể thay ủổi hệ pha ủộng hay dựng chương trỡnh Gradient dung môi. Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình dung môi thì một số pha ủộng cú tỷ lệ thay ủổi sẽ kộo theo sự thay ủổi ủường nền làm ảnh hưởng rất lớn ủến thời gian lưu và diện tích của các peak ta phân tích. Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trỡnh Gradient dung mụi mà chủ yếu là chỳng ta phải tỡm ủược hệ pha ủộng rửa giải phự hợp, ủỏp ứng cỏc yờu cầu trong quỏ trỡnh phõn tớch.
2.3.6. Hệ số khụng ủối xứng T (Tailing factor):
Hệ số khụng ủối xứng T cho biết mức ủộ khụng ủối xứng của peak trờn sắc ký ủồ thu ủược. T ủược tớnh bằng tỷ số ủộ rộng của 2 nửa peak tại ủiểm 1/10 chiều cao Peak:
b
T = a (18)
Peak dạng ủối xứng hỡnh Gauss trờn thực tế khú ủạt ủược vỡ vậy phải quan tõm ủến hệ số khụng ủối xứng T.
− Khi T < 2.5 thỡ phộp ủịnh lượng ủược chấp nhận.
− Khi T > 2.5 thỡ ủiểm cuối của peak rất khú xỏc ủịnh, vỡ vậy phộp ủịnh lượng cần phải thay ủổi cỏc ủiều kiện sắc ký ủể làm cho peak cõn ủối hơn theo cỏc cỏch sau:
Làm giảm thể tớch chết tức là ủoạn nối từ cột ủến detector.
Thay ủổi thành phần pha ủộng sao cho khả năng rửa giải tăng lờn
Giảm bớt lượng mẫu ủưa vào cột bằng cỏch pha loóng mẫu hay giảm thể tớch tiờm mẫu.