2.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện: từ 4/2011 đến 03/2012
Địa điểm: tại Phòng thí nghiệm Nedo, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp
& Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm
Mẫu lúa
Các mẫu lúa giám định được thu thập tại Tiền Giang trong vụ Hè Thu năm 2011. Sau khi thu mẫu về để khô tự nhiên trong không khí và trữ trong giấy báo.
Nguồn nấm
Các nguồn nấm được phân lập từ các mẫu lúa bệnh ở tỉnh Tiền Giang trong vụ Hè Thu 2011.
Môi trường sử dụng trong thí nghiệm
Môi trường potato dextrose agar (PDA) (Shurtleff và Averre, 1999).
Agar 20g
Đường dextrose 20g
Khoai tây 200g
Nước cất 1000ml
pH 6,7
Giống lúa để lây bệnh nhân tạo: IR50404 2.1.3 Phương tiện thí nghiệm
Tủ thanh trùng ướt, tủ thanh trùng khô, tủ cấy, tủ úm, kính soi nổi, kính hiển vi, lame, lamelle.
2.2 Phương pháp giám định
2.2.1 Giám định thành phần nấm gây bệnh trên hạt
Thu thập mẫu bệnh
Mẫu được thu thập ở Tỉnh Tiền Giang trong vụ Hè Thu năm 2011 và Đông Xuân 2011-2012.
Cách thu mẫu trên ruộng lúa: trên mỗi ruộng thu từ 20-30 bông lúa bệnh ở nhiều điểm khác nhau. Phương pháp thu mẫu theo đường hình ziczac hay năm điểm chéo góc.
17
Phương pháp xác định thành phần nấm gây bệnh trên hạt
Khi giám định tùy từng trường mà áp dụng một số bước hoặc tất cả các bước của quy tắc Koch (Burgess và ctv., 2009). Đối với bệnh mới hoặc bệnh chưa xác định thì áp dụng cả 4 bước của quy tắc Koch.
Nguyên tắc giám định bệnh theo quy trình Koch gồm 4 bước:
Bước 1: mô tả triệu chứng và tìm mầm bệnh trong mô bệnh.
Bước 2: phân lập, tách ròng và định danh mầm bệnh.
Bước 3: tiêm chủng mầm bệnh đã phân lập vào cây khỏe. Quan sát lại triệu chứng bệnh xuất hiện.
Bước 4: tái phân lập mầm bệnh từ vết bệnh được tiêm chủng và so sánh với mầm bệnh ban đầu.
Đối với bệnh đã được báo cáo nhiều lần trong nước và trên thế giới chỉ áp dụng bước 1 và 2 của quy tắc Koch.
Đối với bệnh chưa xác định rõ tác nhân được đánh dấu (?).
Các bước tiến hành:
Ủ hạt lúa cho nấm phát triển
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 lần lặp lại, gồm 30 nghiệm thức cho vụ Hè Thu và 10 nghiệm thức cho vụ Đông Xuân, ủ hạt theo phương pháp Blotter (ISTA, 1985).
Cách ủ hạt: mỗi đĩa petri chứa 3-4 lớp giấy thấm đã thanh trùng rồi nhỏ nước cất vừa đủ ẩm. Đặt 25 hạt/đĩa với khoảng cách đều nhau (Hình 2.1). Cho vào tủ úm giữ ở nhiệt độ 30oC trong 3 ngày đầu, sau đó để ở nhiệt độ phòng dưới ánh sáng đèn huỳnh quang xen kẽ 12 giờ chiếu sáng và 12 giờ tối. Thời gian ủ khoảng 7 ngày.
H nh 2.1 Hạt lúa ủ trong đĩa petri theo phương pháp Blotter
18
Nuôi cấy và tách ròng nấm
Phân lập các tác nhân gây hại quan trọng trên hạt lúa, tách ròng, làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử hay đỉnh sinh trưởng sợi nấm theo phương pháp của Burgess và ctv. (2009) và lưu trữ nguồn nấm để thực hiện các thí nghiệm kế tiếp. Quan sát sự phát triển của nấm trên môi trường PDA, ghi nhận các chỉ tiêu về màu sắc, cách mọc trên môi trường, đo đường kính của tản nấm trên môi trường PDA ở thời điểm 5 ngày sau khi cấy.
Quan sát và mô tả đặc điểm của nấm
Hạt ủ sau 5 ngày đem quan sát dưới kính soi nổi để nhận biết màu sắc cách mọc của sợi nấm trên hạt.
Hạt ủ được 7 ngày thì đem quan sát dưới kính hiển vi để xác định tác nhân gây bệnh trên hạt, ghi nhận chỉ tiêu và quan sát đặc điểm, màu sắc của sợi nấm và bào tử nấm. Đo kích thước trung bình của bào tử (mỗi loài nấm tiến hành đo ngẫu nhiên kích thước của 10 bào tử nấm, sau đó lấy trung bình).
Xác định tên nấm dựa vào khoá phân loại nấm của Barnett và Hunter (1998), tài liệu “Seed-borne disease and seed health testing of rice” của Agarwal và ctv.
(1989), tài liệu “A Manual of Rice Seed Health Testing” của Mew và Misra (1994) và tài liệu “A handbook of Rice seedborne fungi” của Mew và Gonzales (2002); So sánh hình dạng nấm, kích thước, màu sắc của đính bào đài, đính bào tử và ổ nấm.
Lây bệnh nhân tạo và tái phân lập mầm bệnh
Chuẩn bị những cây lúa khỏe, sạch bệnh, trồng chúng cho đến khi gần trổ thì tiến hành lây bệnh nhân tạo.
Phương pháp trồng cây để lây bệnh: sử dụng chậu có đường kính là 25cm, sau đó cho đất vào 2/3 chậu, cho nước vào và tiến hành cây lúa, mạ lúa cấy được 17 ngày tuổi. Mỗi chậu cấy ba khóm, mỗi khóm ba tép mạ. Sau khi cấy được 10 ngày tiến hành bón phân DAP (10g/chậu), khi bông lúa gần trổ bắt đầu lây bệnh.
Phương pháp lây bệnh nhân tạo: nuôi cấy nguồn nấm lây bệnh trong đĩa petri trước khi lây bệnh. Các bông lúa gần trổ được thanh trùng bề ngoài bằng cồn 70o, dùng kim mũi giáo rạch một đường có đường kính 1,5cm, rồi lấy kim mũi giáo khác vạch bông lúa ra rồi đặt các khoanh khuẩn ty nấm vào, phun sương giữ ẩm rồi trùm bông lúa lại bằng bọc nilon. Sau khi lây bệnh 5-7 ngày thì quan sát và ghi nhận triệu chứng trên hạt.
Sau khi lây bệnh 5-7 ngày thì đem bông lúa đã lây bệnh, ủ trong đĩa petri có lót giấy thấm được làm ẩm, để 1-2 ngày thì quan sát và so sánh với mầm bệnh ban đầu.
19
2.2.2 Xác định tần số xuất hiện của nấm gây bệnh
Xác định tần số xuất hiện của nấm trên từng mẫu lúa trong từng vụ được tính theo công thức:
Số hạt lúa xuất hiện một loại nấm
Tần số xuất hiện (%) = x 100
Tổng số hạt lúa quan sát trong vụ
20
CHƯƠNG 3