CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
6. Nghiên cứu nhiễm sắc thể khổng lồ
Nghiên cứu nhiễm sắc thể khổng lồ có thể tiến hành trên nhiều đối tượng khác nhau. Ruồi giấm cũng được chọn làm đối tượng thí nghiệm vì ruồi giấm là đối tượng quen thuộc trong các nghiên cứu di truyền học. Ngoài ra còn có các đặc điểm thuận lợi khác là:
Vùng búp hóa
- Dễ phá vỡ màng nhân để làm cho nhiễm sắc thể dễ dàng bung ra ngoài khi làm tiêu bản ép.
- Nhiễm sắc thể có kích thước lớn, số lượng nhiễm sắc thể ít.
6.2. Sốc nhược trương
Sốc nhược trương là phương pháp nhằm làm cho các tế bào trương lên, phá vỡ màng nhân và đồng thời giúp cho các nhiễm sắc thể phân tán, không chồng chéo lên nhau thuận lợi cho quá trình quan sát. Vật mẫu được ngâm trong dung dich muối nhược trương trong 1 khoảng thời gian nhất định. Vì đây là dung dịch muối nhược trương nên nước từ môi trường ngoài sẽ đi vào trong tế vào, làm cho các tế bào trương lên, phá vỡ màng nhân và vì vậy các nhiễm sắc thể sẽ bung ra, dễ quan sát hơn.
Trong sốc nhược trương, các loại muối thường được sử dụng như: Citrat natri, NaCl, KCl, CaCl2, hoặc có thể sử dụng hỗn hợp của nhiều muối như NaCl, KCl và CaCl2 (Fankhauser, 2011).
6.3. Cố định mẫu
Cố định là nhằm giữ nguyên cấu trúc các mô cũng như cấu tạo tế bào bằng cách làm chết tế bào thật nhanh trong dung dịch cố định, một loại hóa chất độc đối với tế bào. Chất cố định khi ngấm vào tế bào sẽ làm đình chỉ mọi quá trình sống xảy ra trong tế bào và không gây ra quá trình thuận nghịch (Trần Tú Ngà, 1982).
Ngoài ra, việc cố định mẫu còn nhằm mục đích sau:
- Ngăn chặn quá trình phá hủy do men, hay phá hủy trong các mô.
- Làm cho các mô cứng dễ nhuộn hơn.
Trong thành phần thuốc cố định nhân có thể có: axit acetic, axit cromic, axit osmic, formalin, cồn, chlorofom… và tác dụng của chúng khi cố định như sau:
- Axit acetic là một chất lỏng không màu, có mùi khó chịu, dễ hòa tan trong nước, trong cồn, trong ete… nó ngấm rất nhanh vào mẫu vật, có thể làm cho mẫu vật bị trương lên, gây kết tủa đối với acid nucleic rất tốt.
- Cồn (Ethanol) là chất lỏng không màu, dễ bay hơi, vị nóng và có mùi thơm đặc biệt, dễ bắt lửa, dễ trộn lẫn trong nước và nhiều dung môi hữu cơ khác. Cồn thường được dùng trong các mục đích sau:
+ Dùng các độ cồn khác nhau để loại nước trong quá trình làm tiêu bản cố định hoặc quá trình chuẩn bị để cắt lát mỏng bằng máy cắt.
+ Để cố định đồng thời ngâm giữ nguyên liệu thực vật trong thời gian dài, người ta thường dùng cồn 700 - 900. Những nguyên liệu đã ngâm trong cồn thì không thể dùng để quan sát thành phần của tế bào chất nhưng để nghiên cứu về cấu tạo giải phẫu thì tốt hơn nhiều so với nguyên liệu tươi (dễ cắt, dễ nhuộm hơn, trong các khoảng gian bào không còn bọt khí).
+ Ngoài ra, cồn còn dùng để pha dung dịch làm mềm, các dung dịch cố định, hoặc để rửa vi mẫu sau khi nhuộm màu…
Có nhiều loại chất cố định mẫu vật trong nghiên cứu nhiễm sắc thể như Carnoy, Navashin…Chất cố định Carnoy biến đổi thường được sử dụng trong nghiên cứu tế bào và phôi, đặc biệt khi cần làm tiêu bản tạm thời. Thành phần của thuốc cố định Carnoy biến đổi (3:1) là cồn và axit acetic. Thời gian cố định từ 2 đến 12 giờ. Ở nhiệt độ 0 - 30C vật có thể giữ lâu trong chất cố định này (Trần Tú Ngà, 1982).
Ngoài ra, trong một số trường hợp, để cố định mẫu vật người ta còn sử dụng ngay chính dung dịch thuốc nhuộm mẫu.
Nguyên tắc cố định mẫu vật:
Tính chính xác của kết quả nghiên cứu tiêu bản tế bào phụ thuộc rất nhiều vào quá trình cố định mẫu. Muốn cố định mẫu vật phải thực hiện đúng những nguyên tắc sau đây:
- Chất cố định phải chọn sao cho phù hợp với mục đích nghiên cứu.
- Dung lượng chất cố định phải lớn hơn hẳn dung lượng mẫu vật cần cố định (thông thường phải gấp từ 20 đến 100 lần).
- Vật cố định phải còn tươi nguyên.
- Những mẫu vật có kích thước lớn, nên cắt thành những mẫu nhỏ khi cố định, cắt bỏ những bộ phận không cần thiết để chất cố định có thể ngấm nhanh vào mẫu vật.
- Thông thường thì chất cố định ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Riêng đối với những mẫu vật dùng để nghiên cứu nhiễm sắc thể nên giữ ở nhiệt độ 40C trong ngăn mát của tủ lạnh.
- Thời gian cố định phụ thuộc vào thể chất, vào độ lớn của mẫu vật cố định cũng như vào loại dung dịch cố định. Đối với chất cố định là Carnoy thì thời gian cố định là từ 2 đến 12 giờ, đối với những nguyên liệu cứng rắn thì thời gian cố định có thể kéo dài lâu hơn khoảng 24 giờ.
- Sau khi cố định cần rửa sạch mẫu vật đã cố định bằng chất lỏng thích hợp.
Nếu dung dịch cố định pha trong nước thì dùng nước để rửa, nếu dùng dung dich cố định pha trong cồn thì dùng cồn để rửa.
- Ghi nhãn với nội dung gồm có: số thứ tự mẫu cố định, ngày giờ cố định, tên vật cố định, tên chất cố định…
- Trong thời gian cố định đôi khi phải thay chất cố định mới. Chẳng hạn như sử dụng chất cố định Carnoy nếu trong thời gian cố định thấy dung dịch Carnoy chuyển màu thì thay bằng dung dịch mới.
- Ghi vào sổ theo dõi thí nghiệm những gì đã ghi trên nhãn và ghi thêm mục đích nghiên cứu.
6.4. Nhuộm mẫu
Có thể nghiên cứu nhiễm sắc thể khổng lồ ở ruồi giấm bằng tiêu bản tạm thời với thuốc nhuộm acetocarmine.
Carmine là một dạng nước chiết sắc tố từ những thể lipid trong con cái của một loài côn trùng gọi là coccuscacbi. Carmine nhuộm nhân tế bào và nhiễm sắc thể rất tốt, là một loại thuốc nhuộm không thể thiếu trong nghiên cứu nhanh tế bào và phôi. Thông thường người ta sử dụng carmine trong dung dịch axit acetic 45%
(acetocarmine). Khi sử dụng thuốc nhuộm acetocarmine cần chú ý một số điểm sau:
- Có thể cho thêm một ít muối sắt, thường là sắt (III) clorua (FeCl3), làm cho nhiễm sắc thể bắt màu rõ hơn. Để tránh cho muối sắt làm cho dung dịch bị kết tủa, người ta thường cho từng giọt sắt (III) clorua 1% trong nước vào thuốc nhuộm cho đến khi thuốc nhuộm có màu đỏ thẩm nhưng chưa xuất hiện kết tủa. Dung dịch này không thể để lâu được và sẽ có xuất hiện kết tủa đen nên chỉ cho muối sắt vào trước khi nhuộm đủ dùng trong vài tuần (Trần Công Khánh, 1980).
- Cũng có thể lúc đầu vẫn nhuộm trong thuốc nhuộm acetocarmine bình thường, sau đó mới chuyển sang thuốc nhuộm có muối sắt.
- Trong một số trường hợp nguyên liệu không cần cố định trước mà cho ngay vào thuốc nhuộm acetocarmine. Dung dịch này sẽ đồng thời cố định mẫu vật và nhuộm luôn mẫu vật.
- Thuốc nhuộm acetocarmine dùng để nghiên cứu nhiễm sắc thể, với thuốc nhuộm này thì nhiễm sắc thể có màu đỏ, các phần khác của tế bào có màu hồng nhạt.
6.5. Khử nước
Các tiêu bản tạm thời muốn giữ được lâu, các tế bào không bị mất màu thì phải chuyển sang giai đoạn khử nước, tức là loại bỏ lượng nước trong tế bào. Hóa chất thường được sử dụng là ethanol. Để hạn chế hiện tượng co rúm trong khi loại nước đối với những vi mẫu được tách từ các mô động vật hay thực vật mềm và mỏng, người ta phải loại nước từ từ trong những nồng độ cồn từ thấp đến cao: từ 300, 400, 500,…(Trần Công Khánh, 1980).
6.6. Dán mẫu
Có thể dán cố định bằng: Baume canada, glycerin, glycerin-gelatin.
- Baume canada: là chất lỏng, trong, màu hơi vàng, mùi thơm dễ chịu, tan trong xylen, dùng để gắn những tiêu bản cố định. Khi dùng phải pha loãng trong xylen.
- Glycerin: là chất lỏng sánh, không màu, không mùi, vị nóng và ngọt, trộn lẫn trong nước và cồn, có tác dụng làm mềm mẫu, chống lại những hiện tượng co rúm. Nhưng khi dán mẫu bằng glycerin thì lammelle dễ bị xê dịch, khó làm sạch tiêu bản, glycerin có ảnh hưởng không tốt đến màu sắc của các mẫu nhuộm.
- Glycerin-gelatin: dung làm chất gắn tiêu bản đối với một số loại tiêu bản cố định như tiêu bản phấn hoa…(Trần Tú Ngà, 1982).