Trong đề tài này, chúng tôi lựa chọn môi trường để nuôi ruồi giấm (Drosophila sp.) là môi trường chuối và khóm. Vì ở môi trường hỗn hợp này, ấu trùng sẽ phát triển với kích thước tối ưu (Nguyễn Cẩm Nhung, 2010). Do đó, các tế bào của tuyến nước bọt sẽ to, nhiễm sắc thể có kích thước lớn, dễ quan sát.
2.2. Thu mẫu
Trong giai đoạn chọn dòi, nên lấy dòi ở giai đoạn III, lúc dòi mới vừa bò lên thành lọ. Vì nếu lấy dòi ở các giai đoạn sớm hơn (dòi I hoặc dòi II) thì lúc này tuyến nước bọt còn rất nhỏ, khó tách, khó quan sát. Nếu chọn dòi quá già tức sắp đóng kén thì lúc này chúng ta sẽ gặp khó khăn trong việc tách ấu trùng.
Hình 20: Ấu trùng ruồi giấm (Drosophila sp.) ở giai đoạn dòi III 2.3. Tách tuyến nước bọt của ấu trùng và xử lý mẫu
Để quan sát được nhiễm sắc thể khổng lồ, cần tách lấy mẫu tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm. Chúng tôi lần lượt tiến hành các thí nghiệm sau:
- Thí nghiệm 1: Tách tuyến nước bọt trong môi trường nước cất Tuyến nước bọt sau khi tách khỏi cơ thể ấu trùng trong môi trường nước cất được đem nhuộm, đậy lammelle và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Kết quả cho thấy các tế bào vị vỡ hoàn toàn, không còn giữ nguyên được hình dạng (hình 22).
Hình 21: Nhiễm sắc thể của ruồi giấm (Drosophila sp.) được xử lý trong nước cất (X100)
- Thí nghiệm 2: Tách tuyến nước bọt trong môi trường đẳng trương Theo Sharma (1965), NaCl 0,73% là môi trường đẳng trương của tuyến nước bọt ấu trùng ruồi giấm (Drosophila sp.). Với môi trường này, các tế bào có hình dạng ổn định.
Thí nghiệm được thực hiện như sau: tách tuyến nước bọt trong dung dịch muối đẳng trương (NaCl 0,73%), sau đó nhuộm, đậy lammelle và quan sát. Kết quả cho thấy hầu hết các tế bào giữ nguyên được hình dạng nhưng nhiễm sắc thể còn co xoắn (hình 23). Muốn quan sát rõ hình dạng của nhiễm sắc thể phải ép lammelle sao cho tế bào vỡ ra.
Hình 22: Mẫu tuyến nước bọt trong môi trường đẳng trương (X100) Vì mục tiêu của thí nghiệm là quan sát nhiễm sắc thể khổng lồ trong từng đơn vị tế bào nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm tiếp theo là xử lý sốc nhược trương tuyến nước bọt.
- Thí nghiệm 3: Xử lý sốc nhược trương mẫu tuyến nước bọt
Đầu tiên, chúng tôi xử lý sốc nhược trương cả cơ thể ấu trùng, tức là ngâm ấu trùng vào dung dịch nước muối NaCl. Chúng tôi lần lượt thử nghiệm với các nồng độ 0,6%, 0,5%, 0,4%.
Kết quả cho thấy thời gian sốc nhược trương để có thể quan sát được hình dạng của nhiễm sắc thể khổng lồ ở mỗi cơ thể ấu trùng khác nhau. Nguyên nhân có
thể do kích thước của mỗi cơ thể ấu trùng có sự khác biệt. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn phương pháp sốc nhược trương trực tiếp trên tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi và nồng độ phù hợp nhất được lựa chọn là 0,5%.
Bảng 5: Nghiệm thức nồng độ và thời gian sốc nhược trương
Nồng độ (%) Thời gian Kết quả
0,6 0 phút Đa số nhiễm sắc thể còn hơi co, tế bào trương lên
0,6 1 phút Nhiễm sắc thể bung nhẹ, tế bào
trương lên
0,5 0 phút Nhiễm sắc thể bung nhẹ, tế bào
trương lên
0,5 1 phút Nhiễm sắc thể bung tốt, tế bào
trương lên và không bị vỡ
0,5 2 phút Nhiễm sắc thể bung tốt, tế bào bị vỡ
0,4 0 phút Đa số tế bào bị vỡ
0,4 1 phút Đa số tế bào bị vỡ
Thông qua bảng số liệu trên, chúng tôi đã chọn cách xử lý tuyến nước bọt bằng phương pháp sốc nhược trương trong dung dịch muối NaCl. Nồng độ được lựa chọn phù hợp là 0,5% và thời gian sốc nhược trương là 1 phút.
2.4. Cố định và nhuộm mẫu
Theo Trần Tú Ngà (1982), trong một số trường hợp nguyên liệu không cần cố định trước mà cho ngay vào thuốc nhuộm acetocarmine. Dung dịch này sẽ đồng thời cố định mẫu vật và nhuộm luôn mẫu vật.
Trong đề tài này, chúng tôi thử nghiệm cả hai cách cố định là trong Carnoy biến đổi và trong acetocarmine. Kết quả là chọn cách cố định và nhuộm mẫu bằng cùng chất acetocarmine.
Thí nghiệm tiến hành như sau:
- Thí nghiệm cố định mẫu trong Carnoy biến đổi
+ Nếu cố định cả cơ thể ấu trùng trong dung dịch Carnoy thì chỉ khoảng 15 phút là cơ thể có hiện tượng cứng lại, cơ thể dễ bị đứt thành mảnh, do đó không thể tiến hành tách lấy tuyến nước bọt.
+ Nếu cố định riêng tuyến nước bọt đã được tách ra khỏi cơ thể ấu trùng trong Carnoy thì phương pháp này không thể thực hiện được vì tuyến nước bọt rất nhỏ, trong suốt, rất khó quan sát bằng mắt thường lại dính sát vào lame khi di chuyển mẫu.
+ Nếu nhỏ trực tiếp dung dịch Carnoy lên lame thì dung dịch này bị bốc hơi rất nhanh (vì trong thành phần dung dịch có chứa cồn tuyệt đối).
- Thí nghiệm cố định và nhuộm mẫu trong acetocarmine
Sau khi tiến hành sốc nhược trương tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm trong dung dịch NaCl 0,5%, dùng giấy thấm lau hết dung dịch muối trên lame, nhỏ 1 giọt acetocarmine lên mẫu, đặt lame dưới bóng đèn tròn. Thời gian nhuộm mẫu được thử nghiệm từ 5 phút đến 8 phút.
Kết quả thu được như sau:
Bảng 6: Nghiệm thức thời gian và nhiệt độ nhuộm mẫu
Thời gian nhuộm Nhiệt độ Kết quả
5 phút Dưới bóng đèn tròn Nhiễm sắc thể bắt màu hồng nhạt, tế bào chất bắt màu hồng rất nhạt.
6 phút Phòng Nhiễm sắc thể bắt màu hồng nhạt, tế
bào chất bắt màu hồng rất nhạt.
6 phút Dưới bóng đèn tròn Nhiễm sắc thể bắt màu hồng đậm, tế bào chất bắt màu hồng nhạt.
7 phút Phòng Nhiễm sắc thể bắt màu hồng đậm, tế
bào chất bắt màu hồng nhạt.
7 phút Dưới bóng đèn tròn Nhiễm sắc thể bắt màu hồng đậm hơn, tế bào chất bắt màu hồng nhạt.
8 phút Phòng Nhiễm sắc thể bắt màu hồng đậm, tế
bào chất bắt màu hồng nhạt.
8 phút Dưới bóng đèn tròn Nhiễm sắc thể bắt màu hồng đậm, tế bào chất bắt màu hồng.
9 phút Phòng Nhiễm sắc thể bắt màu hồng đậm, tế
bào chất bắt màu hồng.
9 phút Dưới bóng đèn tròn Nhiễm sắc thể bắt màu hồng đậm, tế bào chất bắt màu hồng đậm.
Thông qua bảng số liệu trên, chúng tôi đã chọn nghiệm thức nhuộm mẫu khoảng 7 phút đặt dưới bóng đèn tròn.
Kết luận: Acetocarmine được sử dụng với vai trò vừa là chất cố định vừa là dung dịch nhuộm mẫu.
2.5. Đậy lammelle
Để quan sát được hình dạng của nhiễm sắc thể khổng lồ ở ấu trùng ruồi giấm (Drosophila sp.), các tế bào của tuyến nước bọt phải được dàn mỏng ra trên tiêu bản. Chúng tôi dùng lammelle để đậy và dàn mẫu.
Vì tế bào được bao bọc bởi màng rất mỏng và dễ vỡ nên thao tác đậy mẫu phải nhẹ nhàng, không cần dùng tay hay đầu kim mũi giáo để ép hay dầm mẫu (sẽ làm cho các tế bào bị vỡ ra và nhiễm sắc thể dễ bị gãy).
2.6. Chuyển sang tiêu bản cố định
Để giữ lại những mẫu vật tốt làm tài liệu dùng cho học tập, giảng dạy và nghiên cứu, các tiêu bản tạm thời phải được chuyển thành tiêu bản cố định.
- Tách lammelle và phân hóa màu trong axit acetic
Tiêu bản tạm thời được lật úp, đặt trong đĩa petri, trên 2 miếng xốp (bông lau bảng được cắt nhỏ). Dung dịch tách lammelle được đổ vào ngập tiêu bản. Sau khoảng 2 phút thì lame và lammelle tách rời nhau ra. Mẫu vật hoàn toàn dính vào lame. Chúng tôi thử nghiệm tách lammelle trong các dung dịch axit acetic 20%, 30% và dung dich cồn: axit acetic (3:1). Kết quả cho thấy:
- Tách lammelle trong dung dịch cồn: axit acetic (3:1): Đối với dung dịch này, mẫu sau khi được tách lammelle, các tế bào bị teo nhiều.
- Tách lammelle trong dung dịch axit acetic 20%: Sau khi lame và lammelle được tách ra, ngâm tiêu bản trong dung dịch này khoảng 30 giây. Kết quả độ tương phản tăng.
- Tách lammelle trong dung dịch axit acetic 30%: Phương pháp được tiến hành tương tự như đối với dung dịch axit acetic 20%. Kết quả thu được giống như khi ngâm mẫu trong axit actic 20%.
Vì vậy, chúng tôi đã chọn tách lammelle và phân hóa màu trong dung dịch axit acetic 20% trong 30 giây.
- Khử nước
Các tiêu bản sau khi được phân hóa màu sẽ được tiến hành khử nước trong các lọ cồn có nồng độ khác nhau từ thấp đến cao. Cụ thể như sau:
Cồn 300 3 giây
Cồn 400 3 giây
Cồn 500 3 giây
Cồn 600 3 giây
Cồn 700 3 giây
Cồn 800 2 giây
Cồn 900 2 giây
Cồn tuyệt đối 1 giây
Trước khi tìm được nghiệm thức này, chúng tôi đã thử rất nhiều nghiệm thức khác. Nếu thời gian khử nước trong các lọ cồn quá lâu (nhất là đối với cồn có nồng độ cao) tế bào sẽ bị teo, ngược lại thời gian khử nước không đủ tế bào sẽ bị mất màu sau vài ngày.
- Làm trong mẫu
Các tiêu bản sau khi được khử nước sẽ chuyển sang lọ xylen I và xylen II trong 5 giây/lọ để làm trong mẫu và tăng độ tương phản giữa tế bào chất và nhiễm sắc thể. Nếu thời gian ngâm trong xylen quá lâu mẫu sẽ bị mờ, tế bào bị teo.
2.7. Hình thái của nhiễm sắc thể
Theo Nguyễn Như Hiền (2006), nhiễm sắc thể khổng lồ của ruồi giấm (Drosophila sp.) quan sát được trên tiêu bản hiển vi bao gồm 5 dải dài và 1 dải ngắn tỏa ra ở vùng tâm nhiễm sắc do hiện tượng tiếp hợp soma. Và do sự tự nhân đôi nhiều lần nên nhiễm sắc thể có dạng đa sợi khổng lồ. Trên các tiêu bản hiển vi thực hiện được, chúng tôi cũng đã quan sát được rõ hình thái của nhiễm sắc thể khổng lồ như mô tả. Dải ngắn nhất là nhiễm sắc thể số 4, 1 dải dài hơn là nhiễm sắc thể X, 4 dải còn lại là 4 nhánh của nhiễm sắc thể số 2 và 3. Tuy nhiên, chúng
tôi chưa quan sát được nhiễm sắc thể Y vì nhiễm sắc thể này bắt màu kém với thuốc nhộm và nằm lẫn trong vùng tâm nhiễm sắc.
Hình 23: Cấu trúc nhiễm sắc thể của ruồi giấm Drosophila sp. (X1.000) Bên cạnh đó, với phương pháp này, chúng tôi cũng đã quan sát được rõ cấu trúc đĩa của nhiễm sắc thể theo như Nguyễn Như Hiền (2006) mô tả: các vùng đậm màu là do chất nhiễm sắc ở trạng thái cuộn xoắn cao (vùng dị nhiễm sắc) còn những vùng bắt màu nhạt hơn biểu hiện trạng thái dãn xoắn (vùng đồng nhiễm sắc) (hình 25).
Có những vị trí trên nhiễm sắc thể có hiện tượng phình ra do các nhiễm sắc thể được mở xoắn (hình 26). Trong một số trường hợp, hai nhiễm sắc thể tương đồng có hiện tượng không tiếp hợp và tách rời nhau ra ở vùng tâm nhiễm sắc (hình 27).
Hình 24: Cấu trúc đĩa của nhiễm sắc thể (X1.000)
Hình 25: Hiện tượng búp hóa (X1.000)
Hình 26: Hai nhiễm sắc thể tương đồng không tiếp hợp (X1.000)