CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp xác định cấu trúc
2.2.3. Phương pháp phổ NMR
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide. Trong phương pháp nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide thì phổ 1H và 13C-NMR thường được sử dụng. Trong một số trường hợp phổ 1H-NMR còn dùng để định lƣợng polysaccharide có trong mẫu phân tích [2,25].
Phổ NMR [18,24,87] đƣợc thể hiện bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TMS, DSS…). Đặc trƣng phổ 1H- NMR và 13C-NMR của glucan đƣợc thể hiện theo Hình 2.3. Trong phổ 1H- NMR tất cả độ dịch chuyển hóa học của carbohydrate bao gồm mono-, oligo-, và polysaccharide có độ chuyển dịch hóa học từ 1-6 ppm trong chất nội chuẩn TMS. Độ chuyển dịch hóa học proton anomer của mỗi monosaccharide đều đƣợc nhận biết riêng phụ thuộc vào cấu hình hay . Nhƣ với proton -anomer sẽ xuất hiện tại δ 5–6 ppm trong khi đó với proton - anomer là tại vùng δ 4–5 ppm. Phổ 13C-NMR thường có tín hiệu yếu hơn nhưng có những lợi thế hơn so với phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc polysaccharide vì độ dịch chuyển hóa học trong phổ 13C-NMR đƣợc trải rộng trên thang đo (Hình 2.3).
Các tín hiệu trên thang đo trên phổ 13C-NMR đã khắc phục đƣợc hiện tƣợng chồng chéo trên phổ 1H-NMR. Trên phổ 13C-NMR các tín hiệu carbon anomer xuất hiện tại vùng δ 90–110 ppm trong khi đó các tín hiệu của carbon không ở vị trí anomer xuất hiện tại δ 60 và 85 ppm. Với polysaccharide có nhóm deoxy nhƣ nhóm –CH3 tín hiệu xuất hiện tại vùng trường cao hơn (15–20 ppm). Với hai loại proton anomer, tín hiệu của carbon -anomer xuất hiện tại δ 95–100 ppm trong khi đó tín hiệu của hầu hết carbon -anomer xuất hiện tại δ 100-105 ppm. Với polysaccharide có chứa nhóm acid uronic, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại δ 170–180 ppm. Các tín hiệu của carbon bậc một có chứa nhóm hydroxyl nhƣ C6 trong pyranose và C5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng cao (δ 60–64 ppm), trong khi đó độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm hydroxyl (C2, 3, 4 trong pyranose và C2, 3 trong furanose) sẽ xuất hiện tại vùng 65–85 ppm. Với nguyên tử carbon alkoylate (C5 trong pyranose và C4 trong furanose) độ chuyển dich hóa học sẽ chuyển về phía trường yếu 5–10 ppm.
24
Các tín hiệu thu đƣợc từ phổ NMR của polysaccharide chƣa xác định ngay đƣợc cấu trúc mà cần đƣợc so sánh với các giá trị của phổ đặc trƣng sau đó để hoàn thiện cấu trúc dùng phổ 2D-NMR và một số kỹ thuật khác. Phổ 1H-NMR có thể đƣợc sử dụng để định lƣợng polysaccharide. Tuy nhiên xuất hiện hiện tƣợng chồng chéo của các tín hiệu proton trong quá trình định lƣợng polysaccharide. Do vậy phổ
13C-NMR với kỹ thuật đo đặc biệt cũng có thể dùng để định lƣợng polysaccharide vì các tín hiệu của carbon anomer được tách riêng trong phổ [24]. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid).
Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng δ 4,4 đến 5,8 ppm. Nhƣ vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của tín hiệu các cộng hưởng proton anomer ta cũng có thể đánh giá tỷ lệ của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích hoá học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H-NMR. Nhìn chung, kết quả phân tích NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hoá học.
Hình 2.2. a) Phổ 1H-NMR của (1 3) và (1 4) -D-glucan; b) Phổ 13C-NMR của (1 3) và (1 4) -D-glucan
Nhiều nhóm thế có thể đƣợc xác định hoặc sự có mặt của chúng đƣợc dự đoán
25
dựa vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H COSY. Tiếp theo, số lƣợng chính xác của các monosaccharide có thể đƣợc khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anomer của phổ hai chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC [24]. Từ các thông số độ chuyển dịch hóa học của C1, H1 thông qua phổ tương tác dị hạt nhân 1H – 13C HSQC có thể đƣa ra đƣợc cấu trúc hóa học cơ bản của monosaccharide [88].
Bảng 2.2. Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu sugabase của dạng glucose, galactose và xylose dung môi D2O
Monosaccharide H-1 C-1
H-2 C-2
H-3 C-3
H-4 C-4
H-5 C-5
H-6a C-6
H-6b
-D-Glcp 5,11 97,5
3,52 72,5
3,76 73,8
3,41 70,7
3,74 72,9
3,64 61,4
3,78
-D-Glcp 4,84 102,9
3,31 74,1
3,55 76,3
3,51 70,4
3,55 76,0
3,77 61,5
3,94
-D-Galp 5,16 99,1
3,89 68,9
3,93 70,2
4,12 68,6
4,11 71,0
3,73 61,7
3,73
-D-Galp 4,68 103,5
3,53 71,7
3,80 73,5
4,08 67,9
3,74 75,5
3,74 61,8
3,74
-D-Xylp 5,18 93,12
3,52 72,41
3,67 73,75
3,61 70,16
3,68(H5a);
3,60(H5b) 61,99 -D-Xylp 4,57
97,53
3,22 75,00
3,43 76,77
3,62 70,27
3,31(H5a);
3,93(H5b) 66,05
Các vị trí được thế của monosaccharide được gọi là vị trí aglycon tương ứng với các nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của liên kết glycoside. Từ dữ liệu NMR, vị trí liên kết đƣợc suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> 3ppm) về độ dịch chuyển hoá học của 13C so với độ dịch chuyển hoá học của các monomer không thế.
Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi methyl hoá. Trật tự các monomer trong mạch polysaccaride đƣợc xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu đƣợc từ hai loại phổ HMBC và NOESY.
Một cách tổng quát, độ chuyển dịch hóa học của polysaccharide đƣợc trình bày theo Hình 2.3.
26
Hình 2.3. Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong polysaccharide
2.2.4 MS
Cho đến tận những năm đầu của thập kỷ 80, việc làm thế nào để phân tích các hợp chất cao phân tử bằng phương pháp phổ khối và làm cho khối phổ trở thành detector mạnh trong kỹ thuật phân tích lỏng vẫn còn là một thách thức. Nguyên nhân chủ yếu là do các nhà khoa học bị giới hạn bởi ý tưởng cho rằng một chất phải luôn được hoá hơi trước rồi sau đó mới ion hoá chúng. Hơn nữa, năng lượng cần thiết để ion hóa các phân tử chủ yếu đƣợc cung cấp từ nhiệt và các phân tử chứa các
“nhóm phân cực” cần đƣợc biến đổi hoá học để có thể hoá hơi đƣợc. Một thời gian dài, đối với nghiên cứu các polysaccharide, phương pháp khối phổ chỉ có thể được áp dụng sau khi đã có sự chuyển hoá hoá học. Trước hết, mẫu được thuỷ phân để tạo thành các monosaccharide hoặc disaccharide, sau đó các tiểu phân này cần đƣợc methyl hoá để có thể phân tích bằng GC/MS. Quá trình phân tích đòi hỏi nhiều thực nghiệm, tiêu tốn thời gian và hoá chất, trong khi kết quả thu đƣợc chỉ cho biết gián tiếp về các monomer hình thành nên mạch mà không cung cấp nhiều thông tin về trật tự liên kết, do các monomer đã đƣợc methyl hoá nên có thể thông tin về nhóm
27
thế của monomer sẽ bị mất đi. Chính vì thế phương pháp phổ khối (MS) sử dụng kĩ thuật ion hoá thông thường không phát huy sức mạnh đối với các mẫu polysaccharide [2].
Cuối những năm 80, vướng mắc về kĩ thuật ion hoá đối với các đại phân tử đã đƣợc giải quyết nhờ sự ra đời gần nhƣ đồng thời của 2 kĩ thuật: ion hóa phu mù điện ESI (Electrospray Ionisation) và sự ion hóa giải hấp laser nhờ mạng lưới MALDI (Matrix-Assited Laser Desorption Ionisation). Đây là bước nhảy vọt về mặt kĩ thuật đã đƣa khối phổ thành một công cụ mạnh trong nghiên cứu các phân tử sinh học lớn, và nó đã được trao giải Nobel 2002 cùng với những thành tựu về cộng hưởng từ hạt nhân. Một ƣu điểm của kĩ thuật ESI là đối với những phân tử lớn có nhiều trung tâm điệ ệ khối lƣợng/điện tích trở nên đủ nhỏ để cho phép chất có thể đƣợc phân tích bằng các máy khối phổ thông thường [4,5].
Theo Jun Liu và Juan [49,50] polysaccharide tự nhiên đƣợc thủy phân (enzym hóa) để thu đƣợc hỗn hợp oligosaccharide và đƣợc kiểm tra bằng phổ MALDI-ToF- MS và phổ khối ESI–MS. Tuy nhiên, hỗn hợp oligopolysaccharide thường phức tạp và các mảnh có khối lượng mol tương đương nhau, do vậy việc xác định cấu trúc hoàn chỉnh là rất khó, nhƣng điều này có thể khắc phục bằng cách sử dụng phổ khối nhiều lần để nghiên cứu cấu trúc một cách hoàn chỉnh. Các nghiên cứu gần đây đã đƣa các dữ liệu trên phổ khối của polysaccharide nhƣ: nhóm khử cuối trong mạch oligosaccharide, các nhóm thay thế nhóm hydroxyl và vị trí liên kết glycoside của oligosaccharide hoặc gán cho các mảnh oligosaccharide đã đƣợc xác định. Tuy nhiên quá trình biến tính, phương pháp tạo dẫn xuất (khử, thủy phân) cần thực hiện cẩn thận để không bị ảnh hưởng đến cấu trúc polysaccharide và dẫn xuất (cấu trúc phụ thuộc vào quá trình khử, môi trường pH).
Kỹ thuật MALDI-ToF-MS và ESI–MS là phương pháp hữu hiệu trong việc xác định trọng lƣợng phân tử của xyloglucan và các dẫn xuất sau khi đƣợc thủy phân và enzym hóa, hai kỹ thuật này đều thu đƣợc dữ liệu nhanh chóng và các phân mảnh nhỏ. Các mảnh phổ và điện tích đƣợc minh họa theo Hình 2.4
28
Hình 2.4. Phổ khối của poysaccharide và dẫn xuất (anion, cation và benzyl amin) đo bằng a) MALDI-ToF-MS và b) ESI–MS
Cả hai phương pháp MALDI-ToF-MS và ESI–MS đều đưa ra các mảnh có khối lượng m/z tương đương nhau và cung cấp thông tin về cấu trúc polysaccharide.
Tuy nhiên phương pháp ESI–MS thì nhậy hơn với ion có m/z nhỏ còn với phương
29
pháp MALDI-ToF-MS thì tốt hơn với oligosaccharide có trọng lƣợng phân tử lớn [50].
Cơ chế phân mảnh của cacbohydrate đã đƣợc đề xuất nhƣ sau [50, 110].
O
O H
OH
OH OH
O
O H OH
OH OH
O
O H OH
OH OH
R
A1
B1 C1
X1
Y1 Z1
B2
C2 Y2 Z2
Hình 2.5. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate
Nhƣ vậy, sự phân mảnh của các oligosaccharide nhìn chung chủ yếu diễn ra ở các vị trí anomer hay ở các liên kết glycoside.
Hiện nay, phương pháp phổ khối lượng với kỹ thuật phổ khối nhiều lần (Tandem – mass spectrometers) là công cụ rất hữu hiệu để phân tích cấu trúc chuỗi của polysaccharide bằng cách sử dụng hai hay nhiều hơn lần phân tích trên một mẫu đo. Phép đo đầu bằng cách chọn một ion muốn nghiên cứu từ hỗn hợp sử dụng từ trường để bắn phá, sau đó xem xét chi tiết các phân mảnh của ion được chọn này để thực hiện phép đo tiếp theo. Kỹ thuật này đƣợc mô tả theo sơ đồ khối sau:
Hình 2.6. Sơ đồ tổng quát về phổ khối nhiều lần