CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
Hoạt tính gây độc tế bào đƣợc tiến hành để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thƣ và không ung thƣ in vitro của các mẫu chiết, cũng nhƣ để kiểm tra độc tính của thuốc với các dòng tế bào ung thƣ và không ung thƣ.
Phép thử này dựa vào khả năng nhuộm màu của SRB (Sulforhodamine B) bám vào protein của tế bào đã đƣợc cố định bởi acid trichloroaxetic (TCA). SRB là chất nhuộm aminoxanthene hồng nhạt với 2 nhóm sulfonic tác dụng gắn với các chất chứa amino acid cơ bản trong điều kiện acid nhẹ, và tách ra trong điều kiện kiềm. Lượng chất màu tách ra từ tế bào được nhuộm là tương ứng với số lượng tế bào [19,46,52].
Độ mạnh của sự bám dính SRB cho phép phản ứng thực hiện trên phiến vi lƣợng 96 giếng. Phản ứng SRB đƣợc chứng minh là có tính ứng dụng bởi lớp tế bào sau khi cố định bởi TCA và nhuộm với SRB có thể được lưu giữ lâu dài.
Chất màu tách ra từ tế bào nhuộm SRB là bền vững. Với tính nhạy cao, sử dụng với phiến 96 giếng và tính bền vững, phản ứng SRB là phù hợp với ứng dụng sàng lọc lớn cũng nhƣ trong nghiên cứu.
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks [69]. Phép thử tiến hành xác định hàm lƣợng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo đƣợc khi thành phần protein của tế bào đƣợc nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo đƣợc tỉ lệ thuận với lƣợng SRB gắn với phân tử protein, do đó lƣợng tế bào càng nhiều (lƣợng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.
33
Giá trị phần trăm sống sót (CS % Cell Survival) là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì đƣợc đánh giá là có hoạt tính.
Giá trị CS(%) đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn Độ lệch σ đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i; : giá trị OD trung bình; n: số giếng thử lặp lại.
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± σ) sẽ đƣợc chọn ra cho thử nghiệm để tìm giá trị IC50.
2.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa
Những phép thử đo hoạt tính chống oxy hóa có liên quan đến việc chuyển nguyên tử hydro hay chuyển electron độc thân. Cơ chế hai phép thử này xảy ra đồng thời phụ thuộc vào cấu trúc của chất chống oxy hóa và pH.
Phép thử theo cơ chế chuyển nguyên tử hydro đựa theo việc đo khả năng của chất chống oxy hóa để quét những gốc tự do bởi sự cho hydro.
X. + AH XH + A.
Phép thử theo cơ chế chuyển electron độc thân đựa theo việc đo khả năng của chất chống oxy hóa chuyển một electron để khử một chất.
X. + AH X- + AH+ AH+ + H2O A. + H3O+ X- + H3O+ XH + H2O
34 M(III) + AH AH+ + M(II)
Trong phép thử dựa trên cơ chế chuyển electron độc thân, phản ứng đƣợc xác định bởi sự khử proton và khả năng ion hóa (IP) của nhóm chức, phép thử này phụ thuộc vào pH, pH càng cao thì giá trị IP càng thấp và tăng sự khử proton. Ở những hợp chất có IP 45kcal/mol thì cơ chế phản ứng thường là chuyển electron độc thân. Phản ứng chuyển electron độc thân thường xảy ra chậm và chịu ảnh bởi những hợp phần vết, chất gây nhiễu, đặc biệt là ion kim loại.
Phương pháp thử chống oxy hóa tổng được thực hiện theo một số tác giả [42, 73, 79, 115] và phương pháp khử sắt được thực hiện theo Zhu và cộng sự [121]
Hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào [26,102] (POL) xảy ra mạnh hay yếu, ở mức bình thường hay bệnh lý là do sự cân bằng giữa các dạng oxide hoạt động và hệ thống các chất chống oxy hóa trong cơ thể. Nhƣ vậy, việc đánh giá quá trình POL có thể suy ra khả năng chống oxy hóa của một chất cần nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu một số tổn thương ở màng theo cơ chế quá trình POL đƣợc áp dụng khá phổ biến. Việc xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lƣợng malonyl dialdehyd (MDA) theo phương pháp của Stroev EA, Makarova VG [107]. MDA là sản phẩm cuối cùng sinh ra trong quá trình POL, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) sẽ tạo ra phức trimethin có màu hồng hấp thụ cực đại ở bước sóng 532nm. Phản ứng thực hiện ở môi trường có pH = 2-3, ở nhiệt độ 90-100oC trong vòng 10-15 phút. Từ cường độ màu của phức ta suy ra lượng MDA có trong mẫu. Hoạt tính chống oxy hóa của chất nghiên cứu đƣợc đánh giá thông qua khả năng làm giảm hàm lƣợng màu của phức hợp này.
Thiết lập đường chuẩn MDA: Hỗn hợp MDA chuẩn 1ml (ở các nồng độ từ 304,5 đến 6090 nM/ml), TCA 10% 1ml, TBA 0.8% 1ml hiện màu ở 1000C 15 phút.
Đo độ hấp thụ màu ở =532nm
35
Hình 2.7. Qui trình đánh giá khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào Hoạt tính chống oxy hóa đƣợc tính theo công thức
HTCO% = [(C MDA chứng– CMDA mẫu thử) / CMDA chứng] x 100
Trong đó C là nồng độ MDA (nM/ml) được tính theo phương trình hồi qui tuyến tính của chất chuẩn MDA. Các kết quả đƣợc tính toán bằng phần mềm TableCurve 2D phiên bản số 4 và Excel để tính giá trị độ lệch chuẩn. Độ chính xác của số liệu đƣợc tính bằng R2. Nếu R2 ≥ 0.99 thì kết quả đƣợc xem là đáng tin cậy.
2.3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Để thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, chúng tôi sử dụng các qui trình trong sách chuyên khảo tại Việt Nam và các qui trình chuẩn hiện đang áp dụng trên thế giới về thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh [29,72,106,108,110].
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh hay yếu của các mẫu thử thông qua đường kính khuếch tán.
ậ vi khuẩn Gr (+), vi
khuẩn Gr (-) ấ vi khuẩn Gr (+), vi khuẩn Gr (-) ấm men đƣợc duy trì và bảo tồn giống trong môi trườ
36
Các vi sinh vật kiểm định được tiến hành hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dịch thể đặc biệt. Sau đó được pha loãng tới nồng độ
ến hành thử nghiệm.
Chất kháng sinh so sánh là Cloramphenicol, Tetracylin và mẫu trắng.
2.3.4. Hoạt tính chống đông tụ máu
Đông máu là một quá trình máu chuyển từ thể lỏng thành thể đặc do sự chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan và các sợi fibrin này bị trùng hợp tạo thành mạng lưới giam giữ các thành phần của máu làm máu đông lại.
Đông máu và chống đông là một quá trình rất phức tạp, cả hai hiện tƣợng này cùng xảy ra, song song tiến triển, nhƣng cuối cùng là để nhằm cầm máu, hoặc tránh hiện tƣợng đông máu tràn lan gây tắc nghẽn mạch máu một khi đã hình thành đủ.
Quá trình đông máu tự nhiên bao gồm một loạt các phản ứng và đối phản ứng mà ở mỗi giai đoạn, sản phẩm đƣợc tạo ra phải nhanh hơn là sự tiêu hủy của nó dẫn đến hiện tƣợng đông máu. Khi cân bằng giữa hai quá trình trên lệch về một phía thì hoặc sẽ có hiện tƣợng máu không đông, hoặc hiện tƣợng máu quá đông.
Phép thử hoạt tính chống đông tụ máu đƣợc tiến hành trên chuột thí nghiệm, kết quả đánh giá qua quan sát trực quan và kiểm tra trạng thái của máu.
2.3.5. Hoạt tính ly giải cục máu đông
Hình thành cục máu đông là một phản ứng tự nhiên để cơ thể tự bảo vệ mình.
Tuy nhiên, cục máu đông sẽ trở nên rất nguy hiểm nếu hình thành ở bên trong mạch máu. Chúng sẽ di chuyển tới khắp mọi nơi trong cơ thể, lên não làm tắc mạch máu não gây đột quỵ, đến tim thì làm hẹp động mạch vành gây nhồi máu cơ tim, điều này sẽ thực sự nguy hiểm, thậm chí là đe dọa tính mạng nếu không đƣợc cấp cứu kịp thời [113].
Kết quả đánh giá là sự thay đổi khối lượng ly giải huyết khối trước và sau các thí nghiệm.
37
Phần trăm ly giải cục máu đông tính bằng sự chênh lệch về khối lượng trước và sau ly giải cục máu đông. Tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần với máu của hai chuột khác nhau.
38