- Đối tượng nghiên cứu: nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc Captopril của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già
2.2. Đối tượng, vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo cellulose từ dịch trà xanh lên men.
- Hóa chất Captopril; các hóa chất khác sử dụng đảm bảo tiêu chuẩn phân tích - Trang thiết bị: Máy quang phổ UV-Vis 2450 (Shimadru-Nhật Bản); Cân phân tích (Sartorius-Thụy Sỹ); Khuấy từ gia nhiệt (IKA-Đức); Tủ sấy, tủ ấm (Binder-Đức); Buồng cấy vô trùng (Haraeus); Nồi hấp khử trùng (HV- 110/HIRAIAMA-Nhật Bản).
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tạo màng CVK trong môi trường nước dừa già
- Khả năng hấp thụ thuốc Captopril của màng CVK lên men từ môi trường nước dừa già
2.4. Phương pháp nghiên cứu
* Phương pháp tạo màng CVK:
Quá trình lên men tạo màng CVK sử dụng quy trình lên men tĩnh: Môi trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các bình lên men có bề mặt thoáng rộng.
Các bình khi lên men được đậy bằng vải xô để tránh nhiễm khuẩn từ môi trường nhưng vẫn giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài. Quá trình lên men diễn ra thuận lợi ở nhiệt độ 28-300C.
Màng Cellulose được tạo ra nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và
12
không khí [10]. Cụ thể quy trình tạo màng CVK lên men từ nước dừa già được thực hiện theo quy trình sau:
- Chuẩn bị môi trường: Nước dừa già sau khi lọc loại bỏ tạp chất được bổ sung các chất dinh dưỡng như bảng 2.1[8].
Bảng 2.1: Môi trường lên men tạo màng Cellulose vi khuẩn
Thành phần Khối lượng
Glucose 20g
Pepton 10g
Diamoni photphat 0,3g
Amoni sulfat 0,5g
Nước dừa già 1000ml
- Hòa tan các chất bằng máy khuấy từ
- Đem dung dịch đã hòa tan hấp trong nồi hấp khử trùng 1130C trong 20 phút - Để nguội, khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi bổ sung 2% acid axetic và 10% dịch giống (thực hiện trong buồng cấy vô trùng).
- Đậy bình bằng vải xô và đưa vào phòng sạch để nuôi cấy.
- Sau 7-14 ngày nuôi cấy thu được màng CVK.
* Phương pháp xử lí màng CVK trước khi hấp thụ thuốc Captopril:
Màng CVK sau khi thu được chứa một lượng lớn môi trường lên men và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất acid acetic. Vì vậy, trước khi hấp thụ thuốc cần phải xử lý màng theo quy trình bằng NaOH 0,3M (Cân 12g
13
NaOH hòa tan vào 1000ml nước cất, sau đó hòa tan dung dịch bằng máy rung siêu âm). Các bước xử lý màng CVK thô trước khi hấp thụ được thể hiện ở hình 2.1:
Hình 2.1: Các bước xử lý màng CVK thô
Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn [9]. Màng sau khi ngâm NaOH được mang đi hấp thanh trùng. Sau đó,
Tách màng CVK thô
Ngâm trong nước 48 giờ
Hấp thanh trùng 1200C trong 20 phút Ngâm trong NaOH 3%
Thu CVK tinh khiết
14
ngâm màng trong nước để trung hòa hết NaOH, thời gian khoảng 48 giờ thu được CVK tinh khiết.
* Phương pháp xây dựng đường chuẩn:
Dùng máy quét quang phổ UV-Vis - Xác định bước sóng cực đại của Captopril
Tiến hành quét phổ của thuốc Captopril trong khoảng bước sóng từ 190nm đến 250nm bằng cách sử dụng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 ta thu được phổ hấp thụ cực đại của thuốc CAP
- Xây dựng đường chuẩn: Sử dụng máy đo quang phổ tử ngoại UV-Vis để ghi mật độ quang hấp thụ của thuốc Captopril.
+ Chuẩn bị mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau: 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%
+ Đo mật độ quang phổ của các mẫu dung dịch ở bước sóng cực đại
+ Tiến hành đo 3 lần lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc để xây dựng đường chuẩn
+ Dựng đường chuẩn và phương trình đường chuẩn bằngMicrosoft Excel
* Phương pháp xác định hàm lượng thuốc Captopril hấp thụ vào màng CVK
Khảo sát với 2 mẫu màng CVK có độ dày 0,5 cm và 1 cm ở nồng độ bão hòa 75mg/ml:
- Chuẩn bị 4 bình, mỗi bình chứa 25ml dung dịch Captopril, nồng độ 75mg/ml (dung môi là nước cất 2 lần).
- Bình 1,2: Cho màng CVK có độ dày 0,5 cm Bình 3,4: Cho màng CVK có độ dày 1cm
15
- Khảo sát sự hấp thụ thuốc Captopril của màng CVK ở hai điều kiện Bình 1,3: Khảo sát trong điều kiện thường (nhiệt độ phòng)
Bình 2,4 : Khảo sát trong điều kiện nhiệt độ 800C
- Sau 1 giờ; 2 giờ, lấy 3,3àl dung dịch trong mỗi bỡnh thớ nghiệm pha loóng bằng dung dịch nước cất với tỷ lệ hợp lý (dùng tỷ lệ như đã xây dựng đường chuẩn), đo quang phổ để xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng cho đến khi giá trị OD không đổi, lấy giá trị OD thay vào phương trình đường chuẩn, xử lý số liệu thu được khối lượng thuốc hấp thụ vào màng. Tiến hành thực hiện thí nghiệm 3 lần lấy kết quả trung bình để tính toán.
Lượng thuốc hấp thụ vào các màng CVK được tính theo công thức:
mht = m1 - m2 (mg)
Trong đó: mht: Khối lượng thuốc Captopril đã hấp thụ vào màng m1: Khối lượng thuốc Captopril ban đầu trong dung dịch m2: Khối lượng thuốc Captopril sau khi màng hấp thu thuốc
Hiệu suất thuốc nạp vào màng được tính theo công thức:
EE(%) = mht/m1 ×100%
* Phương pháp thống kê và xử lí kết quả:
Số liệu thí nghiệm thu được khi xác đinh hiệu suất nạp thuốc được phân tích trên phần mềm Microsoft Excel. Sự khác biệt của giá trị trung bình giữa các công thức được đánh giá nhờ phép so sánh với mức tin cậy 95%.
2.5. Địa điểm tiến hành nghiên cứu
Viện NCKH và ƯD Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
16