3.5 Phương Pháp Nghiên Cứu
3.5.2 Phương pháp nghiên cứu tổ chức học tuyến sinh dục
Mẫu được lấy từ cá sống. Tuyến sinh dục được cắt thành 3 mẫu, mỗi mẫu dày 3 – 5 mm rồi cố định bằng formaline 5%.
b/ Kỹ thuật làm tiêu bản
Tiêu bản được làm tại phòng vi thể giải phẩu bệnh lí của bệnh viện Từ Dũ theo quy trình như sau
- Cố định mẫu: Mẫu tuyến sinh dục được cố định trong dung dịch formalin 5%. Ưu điểm của phương pháp này là cấu trúc tế bào được bảo quản tốt do vận tốc xuyên thấu nhanh. Ngoài ra còn làm tăng sự kiềm tính của cấu trúc khi nhuộm qua mảnh cắt vùi bằng nến.
Mẫu cố định dày 3 - 5 mm, lượng dung dịch cố định có thể tích gấp 20 - 30 lần thể tích mẫu. Cố định mẫu trong 24 - 48 giờ, sau đó rửa nước để loại dung dịch cố định. Quá trình rửa được tiến hành như sau: sau khi đổ hết dung dịch cố định ra, mẫu được rửa dưới vòi nước sạch chảy nhẹ trong 5 phút. Tiếp đến ngâm mẫu trong nước sạch 30 phút. Sau thời gian ngâm mẫu, nước trong lọ đựng mẫu được đổ ra và lại tiếp tục rửa ngâm mẫu. Qua 3 lần rửa và ngâm nước, dung dịch cố định được loại ra khỏi mẫu.
- Đúc bloc (đúc parafin) gồm bốn bước:
+ Khử nước: Sau khi loại dung dịch cố định, mẫu còn chứa nhiều nước nên không thể đúc bloc (do parafin không tan trong nước). Dùng cồn ethylic tuyệt đối để khử bốn lần
Lần 1 và lần 2: 4 giờ/lần.
Lần 3 và lần 4: 6 giờ/lần.
Tiến hành kiểm tra mẫu đã hết nước chưa bằng cách nhỏ vào lọ chứa mẫu một ít toluen và lắc. Nếu toluen đục là còn nước, nếu toluen trong là mẫu đã hết nước.
+ Khử cồn bằng toluen hay xylen:
Chất trung gian này có hai tác dụng là loại cồn và làm tan mỡ, mẫu trở nên trong.
Cho mẫu vào lọ chứa toluen, ngâm 3 lần:
Lần 1 và lần 2: 4 giờ/lần.
Lần 3 và lần 4: 6 giờ/lần.
Kiểm tra thấy mẫu hoàn toàn trong là được.
+ Tẩm parafin:
Cho mẫu vào chén sứ có chứa parafin lỏng, để trong tủ sấy 56oC trong vòng 12 giờ.
Đặc điểm parafin thuần chất là đặc và chắc, trắng đục, óng ánh, chảy đều và dễ cắt. Nhiệt độ thích hợp để cắt parafin là 30 - 35oC.
+ Đúc bloc:
Được thực hiện trong khung bằng kim loại hoặc thanh kim loại gãy góc đặt trên các tấm thủy tinh. Mẫu sau khi tẩm sẽ tiến hành đúc.
Trước hết đổ parafin vào khuôn, dùng kẹp hơ nóng để vào giữa khuôn, hạ nhiệt nhanh bằng nước đá để parafin tạo màng mỏng cố định. Sau 20 - 30r parafin chắc chắn sẽ làm lạnh bloc ngay, sau đó tách khuôn và gọt rửa bloc sau cho mẫu nằm ở trung tâm bloc.
- Cắt tiêu bản:
Bloc được đặt trên máy cắt Microtome cắt mỏng bằng dây ruban, mẫu cắt dày 3 - 4 àm.
Chọn mẫu đẹp đặt trên lame, hơ ấm, kéo dây ruban thẳng để mẫu thẳng và dán lên lame bằng keo albumin.
Trước khi dán, lame phải rửa sạch, không bị mốc. Nếu lame dơ thì rửa trong dung dịch acid sunfurcromic, được pha chế như sau:
Cromatkali: 50 gram
H2SO4: 150mL
Nước cất: 1000mL
Cách pha: Đổ 500mL nước để quậy tan cromatkali, cho H2SO4 vào từ từ sau đó đổ hết nước cất vào. Cho lame vào sau 1 ngày lấy ra rửa sạch lại bằng nước.
Kỹ thuật dán mẫu: dùng mâm sấy để ở 45oC, nhỏ lên lame một giọt albumin, đặt mẫu đã chọn lên lame và để chúng trong mâm sấy. Dùng hai cây kim căng nhẹ mẫu, lấy kim giữ mẫu và nghiên nhẹ lame để anbulmin thừa chảy xuống chén.
Dùng giấy thấm thấm nhẹ xung quanh mẫu và trên mẫu, sau đó lame được để lại mâm sấy khô trong khoảng 20 phút.
- Nhuộm mẫu:
Mẫu được nhuộm theo phương pháp hai màu Hematocylin - Eosin. Mẫu sau khi đúc parafin được cắt và dán lên lame vẫn còn dính parafin. Tẩy parafin bằng cách:
+ Nhúng tiêu bản vào toluen 3 lần, mỗi lần 5 phút.
+ Cho tiêu bản vào ancoformol để chúng hòa tan gelatin trong 5 phút.
+ Rửa tiêu bản lau sạch phần parafin dính xung quanh mẫu.
Sau đó tiến hành nhuộm:
+ Ngâm tiêu bản trong Hematoxylin trong 10 phút.
+ Ngâm và rửa nước trong 30 phút.
+ Ngâm tiêu bản vào dung dịch Eosin trong 6 phút.
+ Rửa nước nhanh.
+ Khử nước bằng alcol isopropilic 3 lần, mỗi lần 2 phút.
+ Dán lameable lên tiêu bản bằng keo permout.
- Quan sát kết quả:
Quan sát dưới kính hiển vi quang học cho kết quả: nhân và màng tế bào trứng bắt màu tím đậm của Hematoxylin, tế bào chất bắt màu tím nhạt, noãn hoàng bắt màu hồng cam của Eosin. Tinh bào cấp I, cấp II bắt màu hồng, tinh tử và tinh trùng bắt màu tím.
c/ Phương pháp phân tích tiêu bản tổ chức học tuyến sinh dục Chụp hình dưới kính hiển vi.
Xác định các giai đoạn phát triển của noãn sào dựa vào tài liệu của Xakun và Buskia (1968).
Xác định các giai đoạn phát triển của noãn bào và phôi dựa vào giáo trình tổ chức phôi của Nguyễn Khoa Diệu Thu và Lê Thị Thanh Muốn (1979).