Chương 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.3. ĐẶC ĐIỂM SINH VẬT HỌC, SINH THÁI HỌC VÀ CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA Streptomyces scabies
1.3.1. Tác nhân gây bệnh
Bệnh ghẻ thường gây hại khoai tây và một số loại cây có củ khác gây ra bởi các loài Streptomyces. Streptomyces spp. là vi sinh vật hiếu khí, dạng sợi, Gram dương, vi sinh vật tiền nhân thuộc bộ Actinomycetales, phân bộ Streptomycineae, họ Streptomycetaceae và chi Streptomyces.
Theo Vũ Triệu Mân và ctv (2007), bệnh ghẻ thường khoai tây do xạ khuẩn Streptomyces scabies (Thaxter) Waksman và Henrici gây ra. Đây là loại sinh vật gây bệnh nằm trung gian giữa vi khuẩn và nấm, theo phân loại nấm chúng thuộc nhóm nấm Bất toàn. Sợi nấm nhỏ mảnh có hình xoắn, không màu. Bào tử được sinh ra với lượng lớn từ sợi nấm, bào tử có hình cầu hoặc hình bầu dục. Một số tài liệu công bố bệnh là do vi khuẩn hình sợi gây ra.
9
Hầu hết các loài Streptomyces được mô tả là loài hoại sinh trong đất. Tuy nhiên, bốn loài đã phát triển thành loài kí sinh và gây bệnh lên các bộ phận dưới mặt đất có giá trị kinh tế của cây có củ. Những loài này (gồm Streptomyces scabiei (S. scabies), S. acidiscabies, S. turgidiscabies và S. ipomea) không liên quan với nhau dựa trên một số tiêu chí bao gồm trình tự DNA của ribosome 16S, mối quan hệ DNA - DNA, các thuộc tính hình thái và sinh hóa (Lambert và Loria, 1989;
Healy và Lambert, năm 1991; Takeuchi và ctv, 1996; Miyajima và ctv, 1998). Các nghiên cứu tốt nhất về các loài gây bệnh này là việc xác định S. scabies là nguyên nhân chính của ghẻ thường trên củ khoai tây. Loài S. acidiscabies cũng gây bệnh trên củ khoai tây (ghẻ trên môi trường axit), nhưng các nghiên cứu chỉ giới hạn ở các vùng: Đông Bắc Mỹ (Lambert và Loria, 1989), Canada (Faucher và ctv, 1992.), Hokkaido thuộc Nhật Bản (Takeuchi và ctv, 1996) và Hàn Quốc (Kim và ctv, 1998b). Các triệu chứng bệnh gây ra do hai tác nhân gây bệnh trên là không thể phân biệt và cả hai loài cũng có thể lây nhiễm thân rễ củ cải (Raphanus sativus L.), củ cải đỏ (Brassica rapa L.) và các cây có củ khác (Loria và ctv, 1997). Loài S.
turgidiscabies lần đầu tiên được thông báo vào năm 1996 và là loài Streptomyces quan trọng thứ ba gây bệnh trên khoai tây (Takeuchi và ctv, 1996; Miyajima và ctv, 1998). Tuy nhiên, phân bố của nó là giới hạn đối với Nhật Bản, Phần Lan, Thụy Điển và Hàn Quốc (Miyajima và ctv, 1998; Kim và ctv, 1998a; Kreuze và ctv, 1999; Lehtonen và ctv, 2004). Loài S. ipomea là tác nhân chính của khoai lang (Ipomoea batatas L.) gây bệnh lên các bộ phận trong đất, vết bệnh phát triển từ các chấm đen xuất hiện trên rễ và phần ngầm của thân cây. Bệnh làm giảm năng suất và giảm chất lượng củ, bệnh có thể gây hại nghiêm trọng hơn trong điều kiện khô hạn và trong đất nghèo dinh dưỡng (Loria và ctv, 1997).
Các loài Streptomyces rất phong phú trong đất, tuy vậy chỉ một phần nhỏ mang gen sản sinh độc tố thaxtomin gây nên bệnh ghẻ. Gen sản sinh độc tố thaxtomin nằm trên một khu vực nhiễm sắc thể riêng biệt được đánh dấu (tạm dịch là “đảo kí sinh”: pathogenicity island - PAI), khu vực này có thể chuyển vị trong các loài Streptomyces (Loria và ctv, 2006).
10
Một loài Streptomyces là tác nhân gây bệnh ghẻ mới đã được phân lập từ khoai tây nhiễm ghẻ có nguồn gốc ở Đông Nam Idaho. Nghiên cứu đã củng cố một mô hình chuyển theo chiều ngang của các yếu tố quyết định khả năng gây bệnh trong các loài Streptomyces, các chủng mới có dấu hiệu mang vùng gen gây bệnh đặc trưng (PAI) của loài Streptomyces, nó có gen mã hóa sinh tổng hợp thaxtomin yếu tố quyết định khả năng gây bệnh và một yếu tố lây bệnh thứ hai enzym tomatinase, mặc dù thiếu một đặc tính gen PAI thứ ba của Streptomyces gen nec1. Các chủng mới có một chuỗi trình tự gen 16 rDNA duy nhất liên quan chặt chẽ đến những loài Streptomyces gây bệnh khác. Chuỗi 16 rDNA này cũng được giải trình tự và kết quả cho thấy thiếu vùng PAI, từ đó thấy rằng những dòng gây bệnh mới phát sinh do chuyển theo chiều ngang của một vùng PAI vào một loài Streptomyces hoại sinh. Các dòng phân lập của chủng mới gây bệnh trên củ cải và khoai tây nguy hiểm hơn so với chủng S. scabies.
Ngoài gây vết tổn thương ghẻ trên củ khoai tây, tổn thương cũng đã được nhìn thấy trên phần thân cây và tia củ ngầm. Sự xuất hiện chủng mới này làm phức tạp thêm sự tồn tại các chủng gây bệnh tại Mỹ (Wanner, 2007).
1.3.2. Phổ kí chủ
Tác nhân gây bệnh ghẻ thường, không chỉ gây bệnh ở khoai tây, mà còn có thể tấn công rễ củ củ cải (Raphanus sativus L.),, củ cải đỏ (Brassica rapa L.), củ cải đường (Beta vulgaris L.), lạc (Arachis hypogaea L.), cà rốt (Daucus carota L.), Rutabaga (Brassica napus L. var. napobrassica (L.) Rchb), cây phòng phong (Pastinaca sativa L.), Mangel (Beta macrorrhiza Steven) và cây củ hạ (Tragopogon porrifolius L.) (Hooker, 1986; De Klerk và ctv, 1997; Goyer và Beaulieu, năm 1997, Bouchek-Mechiche và ctv, 2000). Tất cả các loại cây trồng phát triển các triệu chứng điển hình của ghẻ, trong đó có mụn nước, tổn thương lớn lên và đóng vảy màu nâu đỏ, do đó có thể có dạng như một hố xâm nhiễm mà không cần có mặt của khoai tây. Nhiều loại cây trồng một lá mầm và hai lá mầm cũng đã được báo cáo là có ảnh hưởng tiêu cực khi bị lây nhiễm nhân tạo S. scabies, có thể là do ảnh hưởng độc tính gây ra bởi thaxtomin A, một độc tố thực vật phổ rộng sản xuất bởi
11
các tác nhân gây bệnh (Leiner và ctv, 1996). Ở Nam Phi, S. scabies đã được báo cáo trên lạc (De Klerk và ctv, 1997). Chúng không phải là tác nhân gây bệnh chủ yếu trên lạc, nhưng có thể có ý nghĩa kinh tế nơi khoai tây và lạc được trồng luân canh trong cùng khu vực.
S. scabies có phạm vi ký chủ rộng gây hại trên một số cây trồng như củ cải, cà rốt, củ cải đỏ,... pH đất đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh. Bệnh hại mạnh trong điều kiện pH đất 5,5 - 7,5. Có một số loài tương tự có thể tồn tại và phát triển ở độ pH thấp hơn được phát hiện ở Mỹ (Vũ Triệu Mân và ctv, 2007).
1.3.3. Tính ký sinh
Hiện đã có nhiều suy đoán về các cơ chế gây bệnh của bệnh ghẻ thường, đặc biệt là liên quan đến enzyme ngoại bào và sự sản sinh độc tố (Lawrence và ctv, 1990; Healy, 1991). Nghiên cứu mở rộng vào cuối những năm 1980 cho thấy hoạt động của esterase trong các chất chiết xuất từ môi trường nuôi cấy của một số chủng gây bệnh của S. scabies (McQueen và Schottel, 1987). Người ta tin rằng enzym esterase có thể giúp các tác nhân gây bệnh làm giảm lớp sáp bảo vệ (suberin và cutin) bao gồm các mô phân sinh bần và do đó tạo điểm xâm. McQueen và Schottel (1987) cũng phát hiện rằng bổ sung suberin với kẽm dẫn đến cảm ứng tối ưu sự xuất hiện esterase.
Mặc dù ghẻ thường do các loài Streptomyces là rất đa dạng trên cơ sở sinh lý học, hình thái học, phương pháp lai DNA-DNA và phân tích ribosome. Sự tương đồng trong phổ kí chủ và triệu chứng bệnh đề ra một cơ chế chung của sự gây bệnh.
Tất cả những loài gây bệnh này cùng sản sinh một hoặc nhiều nhóm độc tố thực vật gọi là thaxtomins, chất gây nên cùng triệu chứng bệnh trên kí chủ. Theo Loria và ctv (1997), suy đoán về sự tham gia của các độc tố thực vật này có từ năm 1926, mặc dù King và ctv (1989) chỉ thành công trong việc phân lập và mô tả các hợp chất này 63 năm sau đó. Bằng chứng của sự sản sinh độc chất gây bệnh của Streptomyces spp. cũng đã được báo cáo bởi Lawrence và ctv (1990), các hợp chất được xác định là thaxtomin A và B. Thaxtomin A là độc chất chủ yếu được sản xuất
12
bởi cả hai loài S. scabies và S. acidiscabies trên củ khoai tây, mặc dù một lượng nhỏ các hợp chất khác có liên quan cũng đã được phân lập (King và ctv, 1992; Loria và ctv, 1997). Thaxtomin A đã được chứng minh là gây trương tế bào phân sinh mô thực vật thông qua sự ức chế sinh tổng hợp cellulose (Fry and Loria, năm 2002;
Scheible và ctv, 2003). Vì vậy, giả thuyết hiện nay là Streptomyces spp. thâm nhập vào khu vực mô phân sinh của khoai tây thông qua việc sản xuất thaxtomin A làm ức chế sự phát triển thành tế bào (Loria và ctv, 2003).
Kể từ khi sự sản sinh thaxtomin A là phổ biến đối với các loài không liên quan với nhau, người ta đã đề xuất rằng các tác nhân gây bệnh đã được chuyển vị giữa các loài S. scabies, S. acidiscabies và S. turgidiscabies (Healy và Lambert, 1991; Bukhalid và Loria, 1997; Bukhalid và ctv, 1998). Trong một nghiên cứu để xác định mối quan hệ giữa sự sản sinh độc tố và sự hình thành sợi nấm trên vết ghẻ của Streptomyces sp. (IFO 13767), có sự xuất hiện bệnh nhưng không có bằng chứng của sản sinh thaxtomin (Natsume và ctv, 1996). Trong nỗ lực tiếp theo để chứng tỏ có một yếu tố khác quyết định khả năng gây bệnh của S. scabies, một gen độc lực giả định - nec1 - được xác định. Đó là cơ sở để đưa ra một kiểu hình gen độc đến nhược độc (Bukhalid và Loria, 1997). Ngay sau đó, Bukhalid và ctv (1998) đã báo cáo sự tương quan chặt chẽ giữa sự sản sinh thaxtomin với sự hiện diện của gen nec1 trên S. scabies, S. acidiscabies và S. turgidiscabies và chỉ ra rằng khu vực ORFtnp-nec1 giống nhau giữa các chủng của các tác nhân gây bệnh. Các gen sản xuất thaxtomin cũng như gen nec1 nằm trên một khu vực gen kí sinh (PAI) rất lớn ở S. scabies, S. acidiscabies và S. turgidiscabies (Bukhalid và ctv, 1998, 2002; Healy và ctv, 2000. Kers và ctv, 2005). Bằng chứng thuyết phục hiện tại cho thấy rằng PAI đã được chuyển từ S. scabies sang hai tác nhân gây bệnh ghẻ mới xuất hiện của khoai tây (Kers và ctv, 2005).
S. scabies có thể sinh sản hệ sợi. Nó là dạng sợi bào tử mọc thành hình xoắn ốc có các vách ngăn ngang qua, các vách này có thể thắt lại và gãy ra để tạo thành các bào tử đơn. Bào tử thành thục có màu xám hoặc màu đen. Khi bào tử gặp kí chủ cảm nhiễm, bào tử nảy mầm và bắt đầu quá trình kí sinh (Wharton và ctv, 2006).
13
Gần như pH và ẩm độ đất là yếu tố quyết định đến sự phân bố và xâm nhiễm của bệnh qua các mùa vụ, tuy vậy sự ảnh hưởng của các nhân tố khác chưa được xác định rõ. Ghẻ thường khoai tây gây hại đặc biệt nghiêm trọng khi canh tác trên đất trung tính hoặc kiềm (pH 7,0 hoặc lớn hơn). Một vài chủng vi khuẩn có thể gây hại ở pH bằng 5,0 hoặc thấp hơn, nhưng nhìn chung có thể phòng trừ bệnh hiệu quả nếu đất trồng khoai tây được giữ ở mức pH 5,0 đến 5,2. Trong khoảng pH 5,2 đến 8,0 mức độ gây hại của bệnh sẽ tăng tỉ lệ thuận với độ kiềm của đất. Điều kiện đất ấm và khô trong giai đoạn cảm nhiễm bệnh (hai đến năm tuần sau khi củ bắt đầu hình thành) làm tăng đáng kể mức độ nhiễm bệnh (Osborn và Knoxfield, 1995;
Wharton và ctv, 2006).
Theo Vũ Triệu Mân và ctv (2007), bệnh gây hại mạnh ở những ruộng trồng khoai tây độc canh nhiều vụ liên tiếp. Bệnh hại nặng trong điều kiện nhiệt độ ấm áp, đất khô, đặc biệt là khoai tây trồng ở chân đất cát pha.
1.3.4. Phân bố
Ghẻ thường khoai tây là một trong các bệnh thực vật được biết đến lâu đời nhất và lần đầu tiên mô tả vào năm 1890. Thông tin hiện tại cho thấy ghẻ thường khoai tây phân bố rộng cũng như kí chủ của nó (Loria và ctv, 1997). Chúng hiện diện trong tất cả các khu vực trồng khoai tây của Bắc Mỹ và châu Âu (Keinath và Loria 1989a). Tashiro và ctv (1983) báo cáo có sự nhiễm bệnh ở khu vực Đông Á.
Một báo cáo của Pung và Cross (2000) đã xác nhận sự hiện diện của bệnh này ở Victoria - Úc và đặc biệt là hòn đảo Tasmania. Ghẻ thường cũng xảy ra ở các nước Áo, Đan Mạch, Pháp (Bouchek-Mechiche và ctv, 2000.), Phần Lan, Đức, Hy Lạp (Alivizatos và Pantazis, 1992), Israel (Doering-Saad và ctv, 1992), Hungary, Ireland, Hà Lan, Thụy Điển, Na Uy (Bjor và Roer, 1980), Ba Lan (Sadowski và ctv, 1996), Hàn Quốc (Park và ctv, 2003), Nhật Bản (Miyajima và ctv, 1998) và Vương quốc Anh (Read và ctv, 1995). Bệnh được phát hiện trong tất cả các vùng sản xuất khoai tây của Nam Phi, mặc dù ở các cấp độ khác nhau (Marais và Visser, 1989).
14 1.3.5. Phương thức xâm nhiễm
Để hiểu được cơ chế mà các tác nhân gây bệnh ghẻ xâm nhiễm thì một trong những yếu tố đầu tiên nên xem xét là sinh lý của kí chủ. Củ khoai tây là sự phình lên của đoạn thân cây bao gồm các mắt và các lóng (Adams và Lapwood, 1978).
Khi quá trình tạo củ bắt đầu diễn ra, các mắt thân được phân cách bởi các lóng mở rộng. Lóng hình thành liên tiếp tại đỉnh của củ đang phát triển trải qua một giai đoạn nhạy cảm khi mà chúng mang khí khổng và phát triển các tế bào khí khổng mới. Các lóng non nhất (gọi tắt là A-1 và A-2) mang lỗ thở có khả năng chống sự xâm nhiễm của bệnh ghẻ thường (Adams và Lapwood, 1978). Mặt khác, các tế bào lỗ thở non chưa được suberin hóa giữa các lóng A-3 đến A-5 rất nhạy cảm với bệnh, trong khi các lóng già hơn với sự xuất hiện của suberin ở lỗ thở trở nên kháng lại sự nhiễm bệnh. Trong vài tuần đầu tiên hình thành củ, sự phát triển lóng mới trên củ với tốc độ hai lóng mỗi tuần, do đó mỗi pha hình thành lóng trải qua một giai đoạn nhạy cảm khoảng 10 ngày kể từ 1 - 2,5 tuần sau khi bắt đầu hình thành củ.
Các tác nhân gây bệnh ghẻ thường không phải là một đối thủ cạnh tranh có hiệu quả về vị trí xâm nhiễm hay dinh dưỡng, nhưng nó có khả năng thích nghi tuyệt vời và tự biến đổi để vượt qua tính kháng của vật chủ bằng một cách thú vị.
Sau khi thâm nhập các tác nhân gây bệnh phát triển giữa các tế bào, chủ yếu là giữa các tế bào bên trong tế bào lỗ thở đã phát triển (Adams và Lapwood, 1978). Giống như sự chết tế bào chúng lấy dinh dưỡng trên các tế bào chết này. Sợi nấm hình thành bên trong tế bào chủ chỉ tại các khu vực đã cũ của tổn thương (Labruyére, 1971; Hooker, 1986). Trong khi nhân lên, tác nhân gây bệnh tiết ra một chất sinh hóa (có thể là thaxtomin) để kích thích các tế bào xung quanh tổn thương phân chia nhanh chóng và tổng hợp suberin tại điểm xâm nhiễm. Những lớp suberin này tạo thành một lớp bần cắt chất dinh dưỡng của các tế bào sống do đó giết chết chúng và đồng thời bảo vệ cây chống lại sự mất độ ẩm và sự tấn công của vi khuẩn, cũng từ đó cung cấp mô chết và tạo cho các tác nhân gây bệnh có thêm nguồn thức ăn. Lớp mô bần sau đó đẩy ra ngoài khu vực bị nhiễm bệnh, chu bì khoai tây vỡ và hình thành nên vết ghẻ (Wharton và ctv, 2006).
15
Hình 1.4. Chu kì sinh trưởng của ghẻ thường khoai tây (Wharton, 2006)
Về cơ bản, hầu hết các chủng S. scabies là tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng S. scabies đều gây bệnh và các loài này liên quan chặt chẽ với loài hoại sinh (Healy và Lambert, 1991). Do đó, nghiên cứu biến động mật số của các chủng gây bệnh của các loài này rất khó khăn (Loria và ctv, 1997).
Các dòng Streptomyces rất biến đổi trong tính xâm nhiễm gây bệnh ghẻ thường khoai tây (Wanner, 2004). Từ khi cơ chế kí sinh dựa vào chất thaxtomin được thừa nhận, cơ sở sinh vật học của sự xâm nhiễm đã được thừa nhận là rất khác biệt ở cách sản sinh chất thaxtomin. Các tác giả cũng khẳng định có sự khác biệt ở mức độ sản sinh thaxtomin trong nuôi cấy in vitro giữa các dòng Streptomyces khác nhau về mặt di truyền (Beausejour và ctv, 1999).
Sự tiến hóa của Streptomycetes trong thích nghi tốt với điều kiện mới không phải là bất ngờ khi xem xét sự có mặt khắp nơi của các chi kết hợp gen và sự
16
chuyển vị theo chiều ngang của PAI. Hơn nữa, sự khác biệt về khí hậu hoặc môi trường có thể cho kết quả các dạng gây bệnh ghẻ khác nhau của Streptomycetes tại các khu vực và mùa vụ khác nhau (Wanner, 2006).
Theo công bố của Lambert và ctv (2006), trong hai năm 2000 và 2004, 19 giống khoai tây được trồng và lây nhiễm bằng các dòng phân lập thuộc 2 loài vi khuẩn gây bệnh ghẻ thường S. scabies và S. acidiscabies, không có sự tương tác giữa các giống khoai tây với vi khuẩn lây nhiễm ở cả 2 vụ thí nghiệm. Kết quả này phù hợp với tính độc của vi khuẩn trong việc phát triển vết ghẻ. Kết quả cũng chỉ ra rằng độc tính của vi khuẩn và kĩ thuật canh tác đối với sự xâm nhiễm và phát triển của vi khuẩn là không khác biệt rõ ràng trên các giống khoai tây. Tương tự như vậy, không có sự khác biệt rõ ràng giữa kí sinh và kí chủ về tính kháng và mức độ biểu hiện bệnh trên các giống khoai tây khác nhau.
1.3.6. Sự phát triển và biểu hiện triệu chứng
Các tác nhân gây bệnh ghẻ thường có thể lây nhiễm trên tất cả các bộ phận ngầm của cây khoai tây (Labruyére, 1971). Bộ phận của cây trên mặt đất cũng có thể biểu hiện các triệu chứng sau khi lây bệnh nhân tạo (Hooker, 1986). Ban đầu, tổn thương xuất hiện như là vết nhỏ (5 - 8 mm), màu nâu đỏ, tổn thương mọng nước trên lớp chu bì của củ. Khi tác nhân gây bệnh tiếp tục xâm chiếm củ, kí chủ phát triển vết thương trên chu bì dẫn đến vết tổn thương nâng lên một chút tạo thành các mô thô, mô bần. Những điểm này có thể kết hợp lại để hình thành các mảng có hình dạng bất định, biến màu thành nâu và kết cấu thô (Rich, 1983). Các mảng này có thể bị nứt như triệu chứng nhiễm trùng và có dạng hình sao. Bệnh cũng có thể mở rộng trên củ tạo thành vết ghẻ nông hoặc sâu (Ndowara và ctv, 1996). Khi cắt bỏ hết các vảy trên vết ghẻ, trên thịt củ cơ bản xuất hiện vết bệnh màu vàng rơm và hơi mờ (Rich, 1983).
Ghẻ vảy, cũng được gọi là dạng da voi, phát triển như một lớp bề mặt của các mô bần bao gồm khu vực rộng lớn của bề mặt củ và có thể được gây ra bởi những chủng độc tính yếu của S. scabies (Healy, 1991). Theo Loria và ctv (1997), mô tả các triệu chứng của ghẻ vảy, ghẻ lưới và các chủng Streptomyces liên kết với