Phương pháp điều tra, thu mẫu, phân lập và nhân si- 123docz.net

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phương pháp điều tra, thu mẫu, phân lập và nhân sinh khối các dòng

Tiến hành điều tra, thu mẫu ngẫu nhiên trên ruộng trồng khoai tây tại khu vực Lâm Đồng: Đà Lạt, Đơn Dương, Đức Trọng, Lạc Dương. Mỗi điểm điều tra, lấy mẫu theo phương pháp 5 điểm chéo góc (Viện BVTV, 1997), mẫu lấy phải đại diện cho từng loại đất, từng khu vực. Tại mỗi điểm, mẫu được lấy trên củ thương phẩm (0,5kg / mẫu) tại ruộng trồng khoai tây ở thời điểm gần thu hoạch.

Phân lập mẫu theo phương pháp của Loria và Davis, (1998). Củ khoai tây của các mẫu thu thập có triệu chứng điển hình được khử trùng bề mặt bằng 1,5 % NaOCl trong 1 phút và rửa lại bằng nước cất. Lấy một mẫu mô từ dưới vết ghẻ (thường có màu nâu), nghiền nát bằng cối và chày (hoặc nghiền trong túi nilon đã được khử trùng) trong 5 ml nước cất sau đó để lắng trong 10 phút. Một ít dung dịch thu được được trải đều lên môi trường NPPC Water agar. Đĩa nuôi cấy được nuôi ở 300C trong 10 - 14 ngày, sau đó khuẩn lạc được chuyển vào môi trường YME agar.

Các dòng xạ khuẩn phân lập được được nhân sinh khối theo phương pháp của Wanner và Haynes (2009). Các dòng vi khuẩn đã phân lập được nuôi cấy trong môi trường YME agar ở 280C trong 2 - 3 tuần cho đến khi sinh bào tử đồng nhất. Bào tử được thu bằng cách rửa nhẹ bằng nước cất. Số lượng bào tử được đếm bằng kính hiển vi và buồng đếm hồng cầu, các lượng tương đương được cho vào các bình tam giác 250 ml đựng dung dịch dinh dưỡng vô trùng. Dung dịch nuôi cấy được nuôi trong 14 - 18 ngày, sau đó lấy mẫu và định lượng CFU trên cm3 dung dịch nuôi.

2.3.2. Ảnh hưởng của ẩm độ tương đối giá thể đến bệnh ghẻ thường khoai tây trong lây nhiễm nhân tạo

Mục tiêu thí nghiệm: Xác định ẩm độ giá thể phù hợp nhất trong suốt quá trình lây nhiễm nhân tạo S. scabies lên cây khoai tây nhằm đạt mức độ củ nhiễm bệnh cao nhất trong điều kiện thí nghiệm trồng cây trong chậu tại Đà Lạt.

Thí nghiệm được bố trí trên chậu nhựa theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp 3 chậu, 1 cây / chậu. Dụng cụ, giá thể được khử trùng bằng dung dịch calcium hypochlorite 7% trước khi trồng ít nhất 7 ngày (Phạm Xuân Tùng và ctv, 2008). Chậu nhựa trồng cây có kích thước 20 x 20 x 15 cm.

Sử dụng dòng Streptomyces scabies GTT3 có khả năng sinh trưởng mạnh, khả năng sinh bào tử nhiều làm nguồn vật liệu lây nhiễm. Củ giống sạch bệnh của giống khoai tây Atlantic có tính kháng trung bình với ghẻ củ (The British Potato Council, 2000) được sử dụng làm giống lây nhiễm.

Điều chỉnh pHH2O giá thể nằm trong khoảng 6 - 7. Chuẩn bị 500 cm3 hỗn hợp cát – xơ dừa tiệt trùng (tỉ lệ 1:1) cho vào đáy chậu, sau đó thêm vào 1000 cm3 hỗn hợp cát – xơ dừa có chứa 1010 CFU của Streptomyces lấy từ dung dịch nuôi sinh khối. Trồng cây vào chậu chứa hỗn hợp đã chuẩn bị ở trên. Cây trồng được tưới nước khi đất bị khô (theo từng nghiệm thức) và bón phân 3 tuần 1 lần bằng NPK 12-5-7. Thí nghiệm được để trong điều kiện nhà lưới có bồn xi măng (1,2 x 8 m) và tưới bằng hệ thống ống tưới nhỏ giọt.

Ẩm độ giá thể được xác định bằng máy đo ẩm độ và pH đất cầm tay model:

DM-15 do hãng Takemura, Nhật Bản sản xuất. Ẩm độ được đo vào thời điểm ít nhất 2 giờ sau khi tưới từ đó điều chỉnh lượng nước tưới để duy trì ẩm độ của từng nghiệm thức tùy theo điều kiện thời tiết của từng ngày.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố với 3 nghiệm thức như sau:

- Nghiệm thức 1: duy trì ẩm giá thể trong khoảng 40 - 50 % trong toàn vụ - Nghiệm thức 2: duy trì ẩm độ giá thể trong khoảng 60 - 70 % trong toàn vụ - Nghiệm thức 3: duy trì ẩm độ giá thể trong khoảng 80 - 90 % trong toàn vụ Thu thập số liệu về các chỉ tiêu: số củ trên chậu, khối lượng củ trên chậu và sức sinh trưởng (đánh giá dựa trên quan sát cảm quan và cho điểm, trong đó: 1 – cây sinh trưởng rất yếu, còi cọc; 9 – cây sinh trưởng rất tốt, phát triển cành lá ở mức tối ưu).

Đánh giá mức độ gây bệnh trên củ được thực hiện theo phương pháp đánh giá của Wanner và Haynes (2009) bằng hai chỉ tiêu:

Chỉ tiêu 1: Xác định % ghẻ bao phủ bề mặt (ước lượng bằng mắt) trên từng củ. Tính giá trị trung bình của phần trăm bao phủ trên từng chậu đối với tất cả các củ có đường kính lớn hơn 0,75 cm. (Hình ảnh thang đánh giá – xem phần phụ lục)

Chỉ tiêu 2: xác định mức độ ghẻ trên củ, cho điểm theo phân loại như sau:

 0,25 - 0,5 = có vảy nhám hoặc vết nứt trên bề mặt, màu tối và phân biệt được với các vết nhám thông thường

 1 = có vết thương nhỏ, rải rác trên bề mặt (đường kính từng vết ghẻ < 0,5 cm)

 2 = các vết thương trên bề mặt dính liền nhau (đường kính cụm vết ghẻ > 0,5 cm)

 3 = có vết thương nhỏ có gờ (nổi mụn) rải rác trên bề mặt (đường kính từng vết ghẻ < 0,5 cm)

 4 = các vết thương có gờ, dính liền nhau (đường kính cụm vết ghẻ > 0,5 cm)

 5 = vết thương có lỗ nông hoặc sâu

Giá trị trung bình được ghi lại khi ở mức điểm mà đa số củ thể hiện. Đối với mỗi chậu, giá trị trung bình được tính dựa trên tất cả các củ có đường kính lớn hơn 0,75 cm.

Số liệu thu thập được tính toán, tổng hợp bằng phần mềm excel, phân tích phương sai và xếp nhóm bằng trắc nghiệm đa đoạn Duncan (Duncan’s Multiple Range Test) bằng phần mềm SAS 9.1 (2004). Hai chỉ tiêu: % ghẻ bao phủ bề mặt và mức độ ghẻ trên củ được chuyển sang góc arcsin% trước khi xử lí thống kê khi có độ biến động lớn (CV > 30 %).

2.3.3. Ảnh hưởng của pHH2O giá thể đến bệnh ghẻ thường khoai tây trong lây nhiễm nhân tạo

Mục tiêu thí nghiệm: Xác định ngưỡng pHH2O giá thể phù hợp trong lây nhiễm nhân tạo bệnh ghẻ thường khoai tây trong điều kiện thí nghiệm trồng cây trong chậu tại Đà Lạt.

Chuẩn bị 500 cm3 hỗn hợp cát – xơ dừa tiệt trùng (tỉ lệ 1:1) cho vào đáy chậu, sau đó thêm vào 1000 cm3 hỗn hợp cát – xơ dừa có chứa 1010 CFU của Streptomyces lấy từ dung dịch nuôi sinh khối. Trồng cây vào chậu chứa hỗn hợp đã chuẩn bị ở trên. Cây trồng được tưới nước khi đất bị khô và bón phân 3 tuần 1 lần bằng NPK 12-5-7. Thí nghiệm được để trong điều kiện nhà lưới có bồn xi măng (1,2 x 8 m) và tưới bằng hệ thống ống tưới nhỏ giọt.

pHH2O giá thể được điều chỉnh ngay từ đầu, bón trước toàn bộ số phân bón (pHH2O – từ đây về sau trong luận văn này, khi nói giá trị pH được hiểu là pH thủy phân). pH giá thể được xác định bằng máy đo ẩm độ và pH đất cầm tay model: DM- 15 do hãng Takemura, Nhật Bản sản xuất. Căn cứ giá trị đo kiểm tra pH trước khi tưới để điều chỉnh giá trị pH nước tưới nhằm duy trì khoảng pH của từng nghiệm thức và tiến hành tưới riêng cho từng nghiệm thức.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố với 3 nghiệm thức như sau:

- Nghiệm thức 1: duy trì pHgiá thể trong khoảng 5 - 5,5 trong toàn vụ - Nghiệm thức 2: duy trì pH giá thể trong khoảng 6 - 6,5 trong toàn vụ - Nghiệm thức 3: duy trì pH giá thể trong khoảng 7 - 7,5 trong toàn vụ Duy trì ẩm độ đất 80 % sau trồng, từ 30 - 60 ngày còn 50 - 60 %, sau đó 70 - 80 %, trước thu hoạch 1 - 2 tuần còn 60 – 70 %.

Thu thập và xử lý số liệu tương tự mục 2.3.2.

2.3.4. Ảnh hưởng của giá thể đến bệnh ghẻ thường khoai tây trong lây nhiễm nhân tạo

Mục tiêu thí nghiệm: Xác định được loại giá thể phù hợp cho công tác lây nhiễm nhân tạo bệnh ghẻ thường khoai tây trong điều kiện thí nghiệm trồng cây trong chậu tại Đà Lạt.

Điều chỉnh pHH2O giá thể nằm trong khoảng 6 - 7. Chuẩn bị 500 cm3 hỗn hợp cát – xơ dừa tiệt trùng (tỉ lệ 1:1) cho vào đáy chậu, sau đó thêm vào 1000 cm3 hỗn hợp cát – xơ dừa có chứa 1010 CFU của Streptomyces lấy từ dung dịch nuôi sinh khối. Trồng cây vào chậu chứa hỗn hợp đã chuẩn bị ở trên. Cây trồng được tưới nước khi đất bị khô và bón phân 3 tuần 1 lần bằng NPK 12-5-7. Thí nghiệm được để trong điều kiện nhà lưới có bồn xi măng và tưới bằng hệ thống ống tưới nhỏ giọt.

Các loại vật liệu được sử dụng làm giá thể được chọn là loại dễ kiếm và tiện dụng có tại địa điểm nghiên cứu. Đất mùn đen là loại đất bùn dưới đáy của sông, hồ được vớt lên, để ráo nước và tiến hành ủ vào kho để sử dụng dần. Đây là loại đất tơi xốp, rất thích hợp cho trồng cây đặc biệt là cây con. Cát được sử dụng là loại cát sông có kích cỡ hạt tương đối nhỏ, đã được để ráo nước và sàng loại bỏ các hạt có kích thước lớn. Xơ dừa dưới dạng xơ dừa xay – đất sạch DASA – đã được khử chát và đóng gói bán trên thị trường.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố với 6 nghiệm thức như sau:

- Nghiệm thức 1: 100 % đất mùn đen - Nghiệm thức 2: đất + cát với tỉ lệ 1 - 1 - Nghiệm thức 3: đất + xơ dừa với tỉ lệ 1 - 1 - Nghiệm thức 4: 100 % xơ dừa

- Nghiệm thức 5: cát + xơ dừa với tỉ lệ 1 – 1 - Nghiệm thức 6: 100 % cát

Duy trì ẩm độ đất 80 % sau trồng, từ 30 - 60 ngày còn 50 - 60 %, sau đó 70 - 80 %, trước thu hoạch 1 - 2 tuần còn 60 – 70 %.

Thu thập và xử lý số liệu tương tự mục 2.3.2.

2.3.5. Xác định khả năng gây bệnh của một số dòng xạ khuẩn

Mục tiêu thí nghiệm: Xác định khả năng gây bệnh của các dòng S. scabies phân lập được lên giống khoai tây Atlantic, từ đó sử dụng các dòng có độc tính mạnh để lây nhiễm nhân tạo nhằm chọn tạo giống kháng.

Tiến hành phân lập 11 dòng Streptomyces từ nhiều vùng, nhiều giống khoai tây khác nhau để xác định khả năng gây bệnh của chúng. Các dòng xạ khuẩn phân lập và nhân sinh khối theo phương pháp đã trình bày (mục 2.3.1).

Phương pháp bố trí thí nghiệm, lây nhiễm nhân tạo, chăm sóc, thu thập và xử lý số liệu tương tự mục 2.3.4.

2.3.6. Đánh giá khả năng kháng bệnh của một số dòng / giống khoai tây bằng lây nhiễm nhân tạo

Mục tiêu thí nghiệm: Đánh giá khả năng kháng bệnh của nguồn vật liệu tạo giống đối với quần thể bệnh ghẻ củ khoai tây tại khu vực Lâm Đồng.

Tập đoàn dòng / giống khoai tây làm vật liệu lai gồm: 22 dòng / giống khoai tây có đặc tính nông học tốt, khả năng kháng bệnh cao từ Trung tâm Nghiên cứu Khoai tây, Rau và Hoa; 11 dòng có nguồn gốc từ CIP, là các dòng vật liệu kháng mốc sương và héo xanh mới nhập nội được sử dụng để kiểm tra tính kháng ghẻ củ.

Sử dụng dòng Streptomyces scabies GTT4 có độc tính mạnh xác định từ kết quả thí nghiệm xác định độc tính làm nguồn vật liệu lây nhiễm.

Phương pháp bố trí thí nghiệm, lây nhiễm nhân tạo, chăm sóc, thu thập và xử lý số liệu tương tự mục 2.3.4.

Từ kết quả thu được, tiến hành phân loại mức độ kháng bệnh của các dòng / giống khoai tây dựa trên hai chỉ tiêu theo dõi (mức độ ghẻ và % ghẻ bao phủ bề mặt) theo thang đánh giá của Bradeen (2007) (bảng 2.1).

Bảng 2.1. Phân loại mức độ kháng của khoai tây đối với ghẻ thường (S. scabies) dựa trên hai chỉ tiêu mức độ ghẻ và % ghẻ bao phủ bề mặt

Mức độ kháng Mức độ ghẻ (điểm)

% ghẻ bao phủ bề mặt củ

Kháng 0 Không nhiễm

Kháng trung bình 1 < 1 %

Kháng trung bình 2 1 đến 5 %

Nhiễm trung bình 3 > 5 đến 50 %

Mẫn cảm 4 hơn 50%

Mẫn cảm 5

Phương pháp điều tra, thu mẫu, phân lập và nhân sinh khối các dòng

Phòng trừ bằng hóa chất