Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Là thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang có so sánh nhằm 2 mục tiêu (1) thực trạng và yếu tố ảnh hưởng của sâu răng; (2) so sánh và xác định loại vi khuẩn gây bệnh sâu răng giữa 2 nhóm học sinh sâu răng và không sâu răng.
2.2.2. Mẫu nghiên cứu
Cỡ mẫu được tính theo công thức sau [86]:
d DE Z pq
n= (21−α/2) 2
Trong đó:
n : Cỡ mẫu
z(1- α/2) : Hệ số tin cậy ở mức xác suất 95%
p : Tỷ lệ ước lượng sâu răng vĩnh viễn giai đoạn sớm của học sinh 12 tuổi (p=50%) qua khám khảo sát sơ bộ năm 2008 (cần lấy số liệu mới hơn).
q : Tỷ lệ ước lượng không sâu răng vĩnh viễn giai đoạn sớm của học sinh 7-8 tuổi (q = 22%)
d : Sai số tuyệt đối: 5%
DE : Hệ số thiết kế =1,2
- Tính cỡ mẫu, ước lượng khoảng 400 học sinh cho 2 trường
- Chọn khoảng 100 học sinh trong nhóm sâu răng để xét nghiệm vi khuẩn (cả 2 trường)
•Chọn mẫu:
2 trường THCS, chọn chủ đích. Lập danh sách học sinh 12 tuổi của từng trường sau đó chọn học sinh tham gia nghiên cứu bằng kỹ thuật chọn mẫu ngẫu nhiên đơn (sử dụng bảng số ngẫu nhiên và danh sách học sinh).
2.2.3. Kỹ thuật và công cụ thu thập số liệu
- Kỹ thuật thu thập số liệu bao gồm: Phỏng vấn yếu tố nguy cơ, khám răng miệng và xét nghiệm vi khuẩn
- Kỹ thuật và quy trình chuyển bị trước khi tiến hành khám và can thiệp.
Liên hệ với Trường Trung học cơ sở …..Hải Dương để lên kế hoạch khám và can thiệp.
+ Thu thập danh sách học sinh cấp tại tỉnh Hải Dương + Thu thập thông tin và thủ tục hành chính:
+ Lập danh sách theo: Họ và tên, ngày tháng năm sinh, lớp, địa chỉ và điện thoại liên lạc.
+ Phỏng vấn học sinh và lấy phiếu xác nhận đồng ý tham gia nghiên cứu của học sinh và phụ huynh học sinh.
- Tập huấn và định chuẩn cho cán bộ nghiên cứu về cách thức khám phát hiện sâu răng phỏng vấnvà ghi phiếu đánh giá.
2.2.4. Vật liệu và công cụ thu thập thông tin
* Bộ khay khám răng: khay quả đậu, gương, thám châm, gắp.
Hình 2.1. Bộ khay khám
* Bông, cồn, găng tay, đèn chiếu sáng.
* Nồi hấp vô khuẩn
* Phiếu khám và phiếu thu thập thông tin.
* Máy nén khí có đầu thổi hơi.
* Thiết bị DIAGNOdent 2190-KaVo (Đức).
Hình 2.2. Hình ảnh thiết bị DIAGNOdent pen 2190 2.2.5. Quy trình thực hiện khám lâm sàng
- Bước 1: khám phát hiện sâu răng bằng phương pháp quan sát thông thường theo tiêu chí của hệ thống ICDAS. Quan sát những thay đổi trên bề mặt răng ướt, nếu không phát hiện tổn thương thì dùng tay xịt hơi thổi khô để quan sát những thay đổi có thể có trên bề mặt răng khô. Cây thăm dò đầu tròn có thể hỗ trợ để phát hiện sự mất liên tục trên bề mặt men.
- Bước 2: Khám phát hiện sâu răng và ghi nhận mức khoáng hóa bằng thiết bị DIAGNOdent 2190-KaVo (Đức): cô lập răng bằng bông cuộn, thổi khô mặt răng cần đo, chuẩn hóa thiết bị trên miếng sứ theo hướng dẫn của nhà sản xuất và chuẩn hóa theo cá nhân trên bề mặt răng 11 hoặc 21 lành mạnh trước khi đo mặt răng cần đánh giá.
+ Với bề mặt nhai, mặt má, mặt lưỡi sử dụng đầu dò có mặt tiết diện phẳng, đặt đầu dò nhẹ nhàng trên mặt răng, di chuyển đầu dò dọc theo các rãnh mặt nhai hoặc mặt má, xác định vị trí có giá trị DIAGNOdent cao nhất, xoay thiết bị xung quanh vị trí này theo trục dọc của đầu dò, ghi nhận thông số lớn nhất. Thực hiện ba lần đo tại vị trí này và lấy giá trị trung bình.
+ Với mặt tiếp giáp phía gần hoặc xa, sử dụng đầu dò có mặt tiết diện vát, di chuyển mặt vát của đầu dò vào kẽ răng, hướng mặt vát về phía mặt răng cần đo, xác định vị trí có giá trị DIAGNOdent cao nhất, xoay thiết bị xung quanh vị trí này theo trục dọc của đầu dò, ghi nhận thông số lớn nhất.
Thực hiện ba lần đo tại vị trí này và lấy giá trị trung bình.
2.2.5.1. Các tiêu chuẩn sử dụng trong đánh giá tổn thương sâu răng
Chúng tôi đã xây dựng các tiêu chuẩn đánh giá và ghi nhận sâu răng, nhất là sâu răng giai đoạn sớm dựa trên cơ sở kết hợp:tiêu chuẩn của hệ thống đánh giá và phát hiện sâu răng quốc tế ICDAS (International Caries Detection and Assessment System) [21], [22] trên lâm sàng, kết hợp sử dụng Lazer huỳnh quang Diagnodent pen 2190 để hỗ trợ chẩn đoán, phân loại và ghi nhận lại mức độ khoáng hóa của men ngà răng.
* Nguyên tắc chung:
+ Dùng bông ướt lau sạch mặt răng.
+ Khám và ghi nhận 5 mặt răng của tất cả các răng.
+ Mã số ghi từ D0 đến D3 tùy thuộc mức độ trầm trọng của tổn thương.
+ Khám và ghi nhận riêng: mặt nhai, mặt gần và xa, mặt ngoài và trong, sâu răng kết hợp miếng trám.
* Tiêu chuẩn xác định sâu thân răng - Mã số D0 (răng lành mạnh):
Lâm sàng tương ứng với ICDAS mã số 0 + Không thấy bằng chứng nào có xoang sâu.
+ Sau khi thổi khô 5 giây, không thấy đốm trắng đục hay nghi ngờ có đốm trắng đục.
+ Thiểu sản men, nhiễm Fluor trên răng, mòn răng (cơ học, hóa học), vết dính nội, ngoại sinh.
Chỉ số Lazer DD < 14
Hình 2.3. Hình ảnh răng lành mạnh - Mã số D1 (sâu răng giai đoạn sớm mức D1):
Lâm sàng tương ứng với ICDAS mã số 1
+ Có màu vàng hay nâu thấy rõ khi răng ướt (giới hạn trên hố và rãnh).
+ Có đốm trắng đục hay có sự đổi màu (màu vàng, nâu) sau khi thổi khô 5 giây.
Chỉ số Lazer DD < 21
Hình 2.4. Hình ảnh đốm trắng đục sau thổi khô - Mã số D2 (sâu răng giai đoạn sớm mức D2):
Lâm sàng tương ứng với ICDAS mã số 2
+ Có màu vàng hay nâu lan rộng thấy rõ lan rộng trên hố và rãnh.
+ Đốm trắng đục thấy rõ khi răng ướt.
Chỉ số Lazer DD< 30
Hình 2.5. Hình ảnh đốm trắng đục khi răng ướt - Mã số D3 (sâu răng giai đoạn muộn).
Mã số D3 được sử dụng chung để ghi nhận các tổn thương sâu răng giai đoạn muộn, mã này bao gốm (ICDAS mã số 3, ICDAS mã số 4, ICDAS mã số 5, ICDAS mã số 6).
ICDAS mã số 3
+ Xoang sâu với đốm trắng đục hay màu nâu đen, sau khi thổi khô 5 giây thấy rõ đường vào xoang.
+ Xoang sâu nhỏ vỡ men nhưng không thấy ngà hay bóng mờ bên dưới.
+ Chỉ số Lazer DD >30
Hình 2.6. Hình ảnh đốm trắng đục, nâu ICDAS mã số 4
+ Thấy bóng mờ màu nâu hay đen từ ngà một cách rõ rệt có kèm theo vỡ men hay không vỡ men bên trên (nhưng không thấy ngà).
+ Có xoang sâu ánh màu vàng, nâu, đen nhưng không thấy ngà (đường vào xoang rất nhỏ).
+ Chỉ số Lazer DD >30
Hình 2.7. Hình ảnh sâu ngà
ICDAS mã số 5
+ Xoang sâu thấy ngà, có thể dùng cây thăm dò CPI của WHO để xác định ngà lộ và độ sâu của ngà (nếu có nghi ngờ sâu có thể đến tủy, tuyệt đối không được dùng cây thăm dò).
+ Chỉ số Lazer DD >30
Hình 2.8. Hình ảnh sâu ngà xoang nhỏ ICDAS mã số 6
+ Xoang sâu thấy ngà.
+ Xoang sâu có độ sâu và độ rộng trên1/2 mặt thân răng.
+ Chỉ số Lazer DD >30
Hình 2.9. Hình ảnh sâu ngà xoang to
* Tiêu chuẩn xác định sâu thân răng kết hợp với miếng trám:
- Mã số D0: răng trám tốt không có sâu
Lâm sàng tương ứng với ICDAS mã số 0 + Mặt răng có miếng trám.
+ Không thấy bằng chứng có xoang sâu.
+ Sau khi thổi khô 5 giây không thấy đốm trắng đục hay nghi ngờ có đốm trắng đục.
+ Thiểu sản men hay nhiễm Fluor trên răng, mòn răng (cơ học, hóa học), vết dính nội ngoại sinh.
Chỉ số lazer DD <14
- Mã số D1: răng trám có sâu giai đoạn sớm Lâm sàng tương ứng với ICDAS mã số 1
+ Đốm trắng đục hay có sự đổi màu sau khi thổi khô 5 giây.
+ Chỉ số lazer DD < 21
- Mã số D2: răng trám có sâu giai đoạn sớm Lâm sàng tương ứng với ICDAS mã số 2
+ Có đốm trắng đục lan rộng đến miếng trám ngay khi răng ướt.
+ Có màu vàng hay nâu lan rộng đến miếng trám ngay khi răng ướt.
Chỉ số lazer DD < 30
- Mã số D3: răng trám có sâu giai đoạn muộn
Lâm sàng tương ứng với ICDAS mã số 3, ICDAS mã số 4, ICDAS mã số 5, ICDAS mã số 6
+ Xoang sâu ngay viền miếng trám <5 mm (không có đốm trắng đục hay sự đổi màu trên bề mặt men lành mạnh hay bóng mờ từ ngà).
+ Sâu vỡ men, cement (nhưng không thấy ngà) kết hợp với miếng trám và có bóng mờ từ ngà (cần chú ý phân biệt ánh xám đen của miếng trám Amalgam và bóng mờ từ ngà).
+ Vỡ men lan rộng >5 mm (trường hợp không thấy viền miếng trám, nhưng có sự mất liên tục tại bờ miếng trám và ngà răng thì dùng cây CPI để thăm dò).
+ Xoang sâu lan rộng cả chiều sâu, độ rộng và ngà răng thấy rõ từ thành hay đáy xoang.
2.2.5.2. Nhận định kết quả
Kết quả sau khi khám lâm sàng kết hợp kết quả chỉ số Lazer huỳnh quang đo được, được nhận định như sau:
- D0: không sâu răng.
- D1, D2, D3: có sâu răng.
- D1, D2: có sâu răng giai đoạn sớm - D3: có sâu răng giai đoạn muộn
- Răng vĩnh viễn có sâu: có ít nhất 1 mặt răng khi khám có chỉ số từ D1 trở lên
2.2.5.3. Độ tin cậy
Trong khi khám có 5-10% các mẫu được khám lại bởi cùng một người khám và bởi một người khác để đánh giá độ tin cậy trên cùng người khám và giữa những người khám khác nhau, phiếu khám được ghi lại như bình thường.
Sau đó lập bảng tính chỉ số Kappa và so sánh với phân loại chuẩn [36]:
0,0-0,2 : không phù hợp, phù hợp rất ít 0,2-0,4 : phù hợp nhẹ, phù hợp yếu
0,4-0,6 : phù hợp mức trung bình, phù hợp vừa 0,6-0,8 : phù hợp chặt chẽ
0,8-1,0 : phù hợp hầu như hoàn toàn
Kết quả thu được: chỉ số Kappa=0,8 đạt mức độ phù hợp chặt chẽ trong khám răng miệng.
2.2.6. Các kỹ thuật xét nghiệm vi khuẩn
2.2.6.1. Lấy mẫu xét nghiệm từ niêm mạc miệng
Mẫu xét nghiệm được lấy từ niêm mạc miệng còn phụ thuộc vào vị trí nhiễm trùng viêm quanh răng – sâu răng. Căn nguyên vi khuẩn gây bệnh thường được phân lập từ bệnh phẩm Streptococcus mutan, Lactobacilli, Actinomyces và ở một số trường hợp có ổ viêm có thể gặp Streptococcus beta haemolyticus, Staphylococcus spp, Pseudomonas aruginosa, Klebsiella pneumoniae ...
• Chuẩn bị môi trường và dụng cụ - Môi trường vận chuyển vi khuẩn.
- Tăm bông cán cứng vo trùng hoặc loại có cán đàn hồi đầu là sợi mềm đặc biệt.
- Đè lưỡi vô trùng.
- Máy hút dịch hoặc bơm tiêm loại 6 - 10 ml.
- Tube vô khuẩn có nắp vặn.
• Các bước thực hiện thu thập mẫu xét nghiệm
- Giải thích rõ mục đích thu thập mẫu cho người chuẩn bị cho mẫu kể các các kích ứng có thể xuất hiện trong quá trình thu thập mẫu.
- Ghi đầy đủ thông tin lên dụng cụ chứa mẫu (02 mẫu).
- Đè lưỡi bằng dụng cụ đã chuẩn bị, dùng đèn có nguồn sáng để soi tìm vị trí có viêm hoặc xuất tiết nếu có.
- Dùng tăm bông chà sát nhẹ thành má, khe chân răng và ổ viêm nếu có. Lăn tròn tăm bông một cách nhẹ nhàng xuống khe má và chân răng và để yên vị trí khoảng 5-10 giây đảm bảo tăm bông hút đủ ẩm rồi đưa vào tube đựng môi trường vận chuyển có nắp vặn đã có đủ thông tin.
- Bẻ đoạn trên của tăm bông, phần không chạm vào tube và vặn nắp chặt.
- Dán nhãn trên mẫu xét nghiệm (mã hóa bệnh nhân để bảo mật thông tin).
• Vận chuyển mẫu xét nghiệm
- Mẫu xét nghiệm đều được vận chuyển trong môi trường thích hợp cho vi khuẩn.
- Chuyển nhanh chóng đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt để giảm tối đa sự phát triển của vi khuẩn.
- Nếu để tới 2 - 4 giờ, qua trình vận chuyển mẫu xét nghiệm vi khuẩn cần để trong điều kiện nhiệt độ từ 2 - 8oC/môi trường thích hợp.
• Quy trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn
Nhuộm soi
- Mẫu bệnh phẩm được tiến hành tại phòng nuôi cấy đảm bảo An toàn Sinh học cấp II
- Mẫu được vortex 15-30 giây ở chế độ 1000v/phút để đảm bảo đồng nhất.
- Dàn bệnh phẩm là dịch đã vortex bằng que cấy vô trùng lên lam kính.
- Cố định khi lam khô tự nhiên và nhuộm bằng phương pháp nhuộm gram.
- Soi nhận định và ghi lại kết quả vi khuẩn gram âm, vi khuản gram dương nếu có.
Nuôi cấy phân lập
Cũng từ mẫu đã vortex trên tiến hành nuôi cấy phân lập trên các môi trường MRS – Agar pH 5.5 (de Man, Rogosa and Sharpe); Thạch máu (5-7%
máu cừu); Muller Hinton Agar và MacConkey Agar.
Ủ ấm: môi trường MRS – Agar pH 5.5,trong điều kiện kỵ khí và nhiệt độ nuôi ủ ở 35-37oC. Điều kiện kỵ khí được tạo ra bằng cách sử dụng túi kỵ khí Anaerocult A®(Merck); môi trường thạch máu sẽ được ủ ấm ở 35 – 37oC/5 -7% khí CO2 còn hai môi trường còn lại chỉ để ủ ấm 35 – 37oC tại môi trường thông thường.
Xác định tác nhân là vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm
Môi trường nuôi cấy phân lập được nhận định các dấu hiệu phát triển của vi khuẩn bằng hình thể khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Vi khuẩn sẽ được xác
định hình thể lại một lần nữa bằng phương pháp nhuộm soi để đối chiếu kết quả nhuộm sơ bộ ban đầu từ bệnh phẩm (lam kính lưu).
Xác định lại đặc điểm gram bằng phương pháp “String Test”. Sử dụng que cấy vụ trựng để nghiền khuẩn lạc vi khuẩn trong 50 – 100àl dung dịch KOH 10% và kéo cao đầu que cấy khỏi mặt lam kính. Khả năng kéo màng nhầy lớn từ 5mm trở lên đước xác định là chủng vi khuẩn gram âm, trường hợp không tạo màng nhầy được kết luận chủng vi khuẩn gram dượng. Khi kết quả hai lần nhuộm soi phù hợp, tiến hành định danh tiếp theo.
Phương pháp xác định giống Streptococcus
Giống Streptococcus bằng card định danh API 20 Strep nếu là cầu khuẩn gram dương và có thử nghiệm Catalase âm tính. Kết quả định danh được xác định bằng phần mềm từ nhà sản xuất Bio Merieux qua ApiWeb khi ID (Indentification Diganostic) đạt trên 95%. Các chủng thuần được bảo quản trong các ống thạch nghiêng ở 4oC và trong dung dịch BHI (Brain Heart Infusion) với 10% glycerol ở – 35oC.
Phương pháp xác định giống Lactobacillus
Để xác định các chủng vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus, một số thử nghiệm được thực hiện như sau: quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi;
xác định mối quan hệ với oxy bằng cách cấy trên môi trường thạch sâu; xác định khả năng tạo axít lactic dựa vào sự phân giải CaCO3 trên môi trường Carbonate – Agar và sự đổi màu thuốc thử Uphenmen; thử nghiệm Catalase được thực nghiệm bằng cách sử dụng dung dịch H2O2 3%; xác định khả năng lên men glucose bằng cách nuôi cấy chủng trong môi trường chứa glucose và chỉ thị đỏ phenol. Sau đó, các chủng vi khuẩn có những đặc điểm cơ bản của giống Lactobacillus được xác định chính xác giống Lactobacillus bằng phương pháp PCR. DNA của vi khuẩn được tách khỏi tế bào bằng DNAzol®
Direct (Molecular Research Center, Inc.). 2 mồi Lac1 và Lac2 đặc hiệu cho
giống Lactobacillus được sử dụng. Thiết lập chương trình phản ứng PCR cho máy luân nhiệt (Eppendorf – Gene Amp, Biosystem, PCR system 9700) như sau: bước 1 – 95oC trong 5 phút; bước 2 – lặp lại 30 chu kỳ (mỗi chu kỳ gồm:
95oC trong 1 phút, 55oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút); bước 3 – 72oC trong 7 phút. Sản phẩm PCR mong đợi là các đoạn DNA có kích thước 340 bp.
2.2.7. Các biến số nghiên cứu nên xây dựng bảng
* Biến số độc lập -Tuổi - Giới
- Nhóm can thiệp - Nhóm chứng
* Biến số phụ thuộc
- Tỷ lệ học sinh sâu răng vĩnh viễn chung gồm tất cả các mức độ tổn thương sâu răng: D1, D2, D3
- Tỷ lệ học sinh sâu răng vĩnh viễn giai đoạn sớm tính từ mức D1 - Tỷ lệ học sinh sâu răng vĩnh viễn giai đoạn sớm tính từ mức D2 - Tỷ lệ học sinh sâu răng vĩnh viễn giai đoạn muộn tính từ mức D3 - Giá trị DD đo được trên các bề mặt răng bằng máy Diagnodent 2190.
- Các chỉ số : DMFT, DMFS, DT, MT, FT, DS, MS, FS, D1T, D2T, D3T, D1S, D2S, D3S.
- Tỷ lệ các loại vi khuẩn thường gặp trên trẻ 12 tuổi bị sâu răng vĩnh viễn - Số lượng vi khuẩn thường gặp gây sâu răng vĩnh viễn ở trẻ em 12 tuổi 2.2.8. Phân tích số liệu
Số liệu được thu thập và phân tích bằng phương pháp thống kê y học, sử dụng phần mềm SPSS 16.0, phần mềm R và một số thuật toán thống kê.
Thống kê mô tả bao gồm tỷ lệ phần trăm được dùng để tính các đặc tính bệnh nhân trong mẫu là biến danh định (phân loại) và trung bình, độ lệch chuẩn dùng để tóm tắt các biến số liên tục.
Mối quan hệ tỷ lệ giữa trước và sau can thiệp dùng kiểm định χ2 hoặc kiểm định Exact Fisher khi thích hợp.
- Các kết quả xét nghiệm sinh học phân tử qPCR được ghi lại theo mã Nhập số liệu bằng Excel và xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS.
2.2.9. Hạn chế sai số trong nghiên cứu
Số liệu đã thu thập được, được làm sạch thô sau đó nhập trên chương trình Epi info 6.04 có sử dụng bước nhảy và phần mềm CHECK để hạn chế sai số do nhập số liệu.
Nhóm nghiên cứu gồm các bác sỹ có trình độ chuyên môn cao, được tập huấn kỹ về cách khám, kỹ thuật đo trên máy Diagnodent và cách ghi phiếu.
2.2.10. Đạo đức trong nghiên cứu
Tất cả học sinh tham gia nghiên cứu đều được giải thích và có sự đồng ý của bố, mẹ và nhà trường. Quy trình khám, vấn đề vô khuẩn được đảm bảo không gây ra bất kỳ một ảnh hưởng xấu nào cho trẻ. Trong quá trình nghiên cứu không tiến hành bất kỳ một thử nghiệm nào.
Toàn bộ học sinh tham gia vào nghiên cứu sẽ được khám và tư vấn răng miệng giúp dự phòng các bệnh về răng miệng. Tư vấn chăm sóc răng miệng đúng cách
Thông qua HDDĐ của Viện VSDTTW