Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm tiền khả thi: Thí nghiệm này dùng để lựa chọn nồng độ độc tố Pyrene cho thí nghiệm. Cá chẽm thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên vào các nghiệm thức có nồng độ độc tố Pyrene khác nhau (0; 50; 100; 150; 200 nM) ở nhiệt độ là 28ºC. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 03 lần. Bể thí nghiệm là chai thủy tinh có thể tích 1 lít và được sục khí liên tục. Mật độ cá bố trí thí nghiệm là 10 con/chai. Thức ăn cho ăn trong quá trình thí nghiệm là copepod. Hoạt động bơi lội và tỷ lệ sống của các nghiệm thức được quan sát sau 24h, 48h và 72h. Nồng độ được chọn là sau thời gian quan sát thấy cá bớp có hoạt động yếu hoặc tỷ lệ chết 50% sau thời gian cảm nhiễm.
Nồng độ này được dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Quá trình diễn biến của tiền thí nghiệm được mô tả thông qua Hình 2.1.
Hình 2.1 Sơ đồ tiền thí nghiệm chọn nồng độ độc tố pyrene cho các thí nghiệm.
Thí nghiệm cảm nhiễm với Pyrene và hạt vi nhựa ở 02 thang nhiệt độ khác nhau là 28ºC và 32ºC. Thí nghiệm được chia ra thành 02 giai đoạn và được xem là thí nghiệm thứ nhất (giai đoạn cảm nhiễm) và chuyển tiếp sang thí nghiệm thứ hai (giai đoạn phục hồi). Cá chẽm có kích cỡ (KL= 0.006±0.002 g và CD= 0.80±0.07 cm) được dùng làm dùng làm thí nghiệm. Thí nghiệm được thiết kế với ba yếu tố là Pyrene, hạt vi nhựa và nhiệt độ. Nồng độ Pyrene (0, 100 nM) được lựa chọn dựa vào kết quả tiền thí nghiệm, hạt vi nhựa (0, 100 hạt/L) ở 02 thang nhiệt độ 28ºC được hiểu như là điều kiện nhiệt độ bình thường và ở 34ºC biểu thị cho nhiệt độ tăng lên theo theo trung tâm dự báo biến đổi khí hậu. Mỗi nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại 10 lần. Số lần lặp được qui ước là một bể thí nghiệm. Mỗi bễ thí nghiệm có thể tích 100 mL được bố trí 01 con cá có kích thước được đề cập ở trên và sục khí liên tục. Thí nghiệm sẽ được tiến hành cảm nhiễm Pyrene và hạt vi nhựa. Copepod sẽ được dùng cho ăn trong suốt thời gian thí nghiệm này cho đến 14 ngày. Nước trong các bể thí nghiệm được thay 2 ngày/lần. Hoạt động bơi lội, tỷ lệ sống, tốc độ tăng trưởng và hô hấp của cá được đánh giá trong suốt thời gian này. Đây là thời gian kết thúc thí nghiệm thứ nhất. Trước khi kết thúc thí nghiệm thứ nhất thì 10 con cá sẽ cho nhịn đói 12h để kiểm tra tốc độ bắt mồi và 06 con cá sau đó cũng cho nhịn đói để kiểm tra hô hấp. Các thông số về sinh
50 nM 100 nM 150 nM 200 nM
Cá chẽm thí nghiệm (KL= 0.006±0.002 g và CD= 0.80±0.07 cm)
0 nM
Nồng độ độc tố Pyrene ở nhiệt độ 28ºC
Quan sát hoạt động bơi lội và tỷ lệ sống của cá sau 24h, 48h và 72h
Chọn nồng độ Pyrene mà có cá hoạt động yếu hoặc 50% cá chết
trưởng cũng như tỷ lệ sống cũng được đánh giá sau khi kết thúc giai đoạn phơi nhiễm.
Sau thời gian này, cá ở từng nghiệm thức thí nghiệm sẽ chuyển sang điều kiện nuôi bình thường không có Pyrene và hạt vi nhựa ở điều kiện nhiệt độ bình thường 28ºC.
Thời gian nuôi phục hồi là 14 ngày. Trước khi kết thúc giai đoạn nuôi phục hồi thì 10 con cá sẽ cho nhịn đói 12h để kiểm tra tốc độ bắt mồi và 06 con cá sau đó cho nhịn đói 12h để kiểm tra đánh giá hô hấp. Copepode và artemia trưởng thành được dùng cho ăn trong suốt thời gian nuôi phục hồi. Nước trong các bể thí nghiệm được thay 2 ngày/lần. Các thông số như khối lượng đạt được, chiều dài đạt được, tốc độ sinh trưởng đặc trưng (SGR), tỷ lệ sống và hô hấp được đánh giá khi kết thúc thí nghiệm.
Sơ đồ minh họa cho thí nghiệm thứ nhất và thứ hai được thể hiện thông qua Hình 2.2.
Cách pha và chuẩn bị pyrene
Cách pha 1 mM pyrene đã được thực hiện bằng cách hòa tan bột pyrene với khối lượng 20,2 mg trong 100 ml acetone và sử dụng pipet 10 ml để pha trộn và đảo đều để pyrene hòa tan hoàn toàn trong dung dịch acetone. Dung dịch này được giữ trong một chai thủy tinh màu nâu để tránh tiếp xúc ánh sáng và giữ lạnh ở 4°C trong điều kiện bóng tối.
Hạt vi nhựa
Hạt vi nhựa có màu đen Polymer siêu nhỏ với kích thước của nó là 200 mm±4 mm và được rửa sạch bằng nước ngọt và pha loãng với 1 lít nước ngọt. Trước khi dùng sẽ được đếm số lượng chính xác rồi đưa vào bể thí nghiệm.
3.4.3 phương pháp thu thập dữ liệu
Hình 2.2 Sơ đồ khối bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của pyrene, hạt vi nhựa và nhiệt độ lên hoạt động bơi lội, khả năng bắt mồi, sinh trưởng, tỷ lệ sống và hô hấp.
Thí nghiệm 1Thí nghiệm 2 Cá chẽm thí nghiệm (KL= 0.006±0.002 g và CD= 0.80±0.07 cm)
Nồng độ Pyrene (0, 100 nM) từ thí nghiệm tiền khả thi
Không bổ sung hạt vi nhựa
Quan sát và đánh giá hoạt động bơi lội và tỷ lệ sống sau 14 ngày
Bổ sung hạt vi nhựa 100 hạt/L
Nhiệt độ 28ºC Nhiệt độ 32ºC Nhiệt độ 28ºC Nhiệt độ 32ºC
Điều kiện nuôi bình thường không bổ sung hạt vi nhựa và Pyrene
Cho cá nhịn đói 12h rồi tiến hành cho copepod vào từng bể thí nghiệm
Khả năng bắt mồi sau 15’ và hô hấp Xác định tỷ lệ
sống, sinh trưởng ở các nghiệm thức
Thí nghiệm không bổ sung Pyrene, hạt vi nhựa
Thí nghiệm được tiến hành nuôi phục hồi 14 ngày
Thí nghiệm có bổ sung Pyrene và hạt vi nhựa
Nhiệt độ 28ºC Các nghiệm thức thí nghiệm được chuyển
sang tương ứng và cho cá ăn bằng thức ăn copepod và artemia trưởng thành
Đánh giá sinh trưởng, tỷ lệ sống, khả năng bắt mồi và hô hấp