PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp xác định thành phần hóa học của phế liệu tôm 3.4.1.1. Xác định hàm ẩm của nguyên liệu
a, Nguyên tắc
Độ ẩm của nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy ở 105oC đến khối lượng không đổi.
b, Cách tiến hành
- Hộp nhôm sấy ở 105oC trong 4h. Sau 4h đem làm nguội trong bình hút ẩm và cân (chính xác đến 0,0001).
- Cân m(g) mẫu nguyên liệu đã nghiền nhỏ cho vào hộp nhôm đã biết trọng lượng.
- Đặt hộp nhôm vào tủ sấy ở 105oC trong 4h. Sau 4h đem làm nguội trong bình hút ẩm và cân.
- Tiếp theo lại đặt hộp xác định ẩm đó vào tủ sấy và sấy tiếp khoảng 40- 45 phút rồi lại làm nguội và cân. Quá trình sấy sẽ kết thúc khi sai lệch giữa hai lần cân không quá 0,001g [10].
c, Tính kết quả
- Độ ẩm của nguyên liệu W(%):
W (%) = ( )
( )
M1 M2
100 M1 M
− ×
− Trong đó:
M1: Khối lượng hộp nhôm và mẫu trước khi sấy (g).
M2: Khối lượng hộp nhôm và mẫu sau khi sấy (g).
M: Khối lượng hộp nhôm ban đầu (g).
3.4.1.2. Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl a, Nguyên tắc:
* Vô cơ hóa mẫu:
Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay các mô được gọi là nitơ tổng số. Nitơ có trong thành phần amino acid của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong thành phần protein như của các muối vô cơ, acid nitric, các amino acid tự do, các peptid, ure và các dẫn xuất ure, purin và pirimidin... là nitơ phi protein.
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
- Trước tiên, mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Phản ứng xảy ra như sau:
H2SO4 → 2H2O + 2SO2↑ + O2↑
- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxy hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 lại tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine; carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O, còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,... Chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO, MgO,...
* Chưng cất đạm:
- Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + H2O + 2NH3↑
- NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứa H2SO4 0,1N
2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư
* Chuẩn độ H2SO4 dư:
- Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0,1N H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O b, Cách tiến hành:
Thực hiện lần lượt các thao tác:
- Vô cơ hóa mẫu - Rửa máy
- Chuẩn bị bình hứng c, Tính kết quả:
Hàm lượng nitơ được tính theo công thức sau:
Trong đó:
- X: Hàm lượng nitơ (g/l)
- a: Số mol H2SO4 0,1N đem hấp thụ NH3
- b: Số mol NaOH 0,1N tiêu chuẩn tiêu tốn cho chuẩn độ - V: Số g phẩm vật đem vô cơ hóa
- 0,0014: Lượng g nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N.
3.4.1.3. Xác định hàm lượng khoáng
Cân m (g) mẫu đã xác định độ ẩm cho vào cốc sứ đã được sấy và xác định khối lượng. Nung trong 4h. Sau đó làm nguội trong bình hút ẩm và cân [8].
Công thức:
Hàm lượng khoáng (%) = ( )
( )
W3 W1
100 W2 W1
− ×
− Trong đó:
- W1: Khối lượng cốc sau khi sấy
- W2: Khối lượng cốc và mẫu chưa nung - W3: Khối lượng cốc và mẫu sau khi nung
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan
Hình 3.1: Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan
3.4.2.1. Xác định chế độ khử protein
Quá trình được thực hiện theo sơ đồ hình 3.1 đến hết công đoạn lên men, sau đó xác định hàm lượng protein còn sót.
3.4.2.2. Xác định chế độ khử khoáng
Quá trình được thực hiện theo sơ đồ hình 3.1 đến hết công đoạn lên men, sau đó xác định hàm lượng khoáng còn sót.
3.4.2.3. Xác định chế độ khử màu
Lớp vỏ cứng bên ngoài vỏ tôm có chứa chất màu chủ yếu là astaxanthin, xuất hiện dưới dạng phức chất với các chất vô vơ cũng như protein. Quá trình khử màu được thực hiện song song với quá trình loại protein và loại khoáng.
3.4.2.4. Xác định chế độ deacetyl hóa
Tiến hành deacetyl hóa chitin (hình 3.1) bằng NaOH 40%, 1210C, 40 phút, tỉ lệ NaOH 40% trên bã chitin là 10/1.
3.4.2.5. Xác định chế độ tinh sạch chitosan
Chitosan được tinh sạch theo hai phương pháp:
- Phương pháp 1: ngâm ở nhiệt độ thường và sấy đối lưu
Hình 3.2: Sơ đồ quy trình tinh sạch chitosan bằng phương pháp sấy đối lưu
- Phương pháp 2: ngâm ở 80oC và sấy đông khô
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình tinh sạch chitosan bằng phương pháp sấy đông khô
3.4.3. Phương pháp đánh giá chất lượng chitosan 3.4.3.1. Xác định mức deacetyl hóa của chitosan
Mức độ acetyl hóa (DA) của chitosan được xác định bằng phương pháp đo quang (OD) [14].
Cách tiến hành như sau: pha chitosan nồng độ 120mg/l trong dung dịch HCl 0,1M. Dung dịch thu được đem đo OD ở bước sóng 201nm, xác định được giá trị mật độ quang A, đối chứng là dung dịch acid HCl 0,1M. Độ acetyl của mẫu (m mg chitosan trong V lít dung dịch) được tính theo công thức:
DA = (161.1 .A.V – 0.0218m) / (3.3615m – 42.1.A.V) (%), Mức độ deacetyl tính theo công thức:
DDA = 100 - DA (%) Trong đó:
DA: Mức độ acetyl hóa
A: Mật độ quang đo của dung dịch chitosan V: lít dung dịch HCl 0,1M
m: mg chitosan
DDA: Mức độ deacetyl hóa của chitosan 3.4.3.2. Xác định độ nhớt của dung dịch chitosan
Sử dụng máy đo độ nhớt “Dial reading Viscosity” để đo độ nhớt của chitosan. Cách tiến hành như sau:
Cân 1g chitosan hòa tan trong 100ml acid acetic 1%, được dung dịch chitosan 1% đem đi xác định độ nhớt, chọn tốc độ trục quay là 50 vòng/phút, độ nhớt được tính theo công thức:
η = a.20 Trong đó:
η: Độ nhớt, cps a: chỉ số đo được 20: hệ số của máy
3.4.3.3. Xác định khả năng kháng vi sinh vật của chế phẩm chitosan thu được Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của chitosan
Hoạt tính kháng vi sinh vật của chitosan được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy đối kháng trong dịch lỏng được thực hiện theo phương pháp đã mô tả trước đây và có hiệu chỉnh để phù hợp [21], cụ thể như sau:.
Hình 3.4: Sơ đồ phương pháp đối kháng trực tiếp trong dịch nuôi cấy lỏng Dịch đối kháng, nuôi ở nhiệt độ
thích hợp (37oC) 0,1ml vi sinh vật
hoạt hóa 24h, định lượng mật độ vi sinh vật
0,4ml chitosan ở các nồng độ, kiểm chứng đệm acetate
Sau 24 giờ, xác định sự sống sót của vi sinh vật.
Eppendorf chứa 0.5ml MP
PHẦN 4