4.2.1. Kết quả nghiên cứu công đoạn khử protein
Tiến hành thủy phân PLT bằng enzyme Alcalase 1% với pH=9, nhiệt độ 60oC, thời gian 165 phút; kết thúc quá trình thủy phân tháo tách dịch thủy phân thu bã vỏ tôm, sau đó lên men bã vỏ tôm bởi L.Plantarum NCDN4 với các thông số: nhiệt độ 300C, thời gian 4 ngày, pH=6, tỉ lệ tiếp giống 20%
(v/w), tỉ lệ dung dịch glucose nồng độ 12,5% là 20% (v/w). Xác định hàm lượng protein trong bã vỏ bằng phương pháp kjendahl được trình bày trong mục 3.4.1.2
Kết quả thu được như sau:
Bảng 4.2: Hàm lượng protein còn sót lại trong vỏ tôm sau khử protein Mẫu Hàm lượng protein/chất khô tổng số (%)
Nguyên liệu 43,49
Sau thủy phân 15,09
Sau lên men 7,98
Kết quả nghiên cứu cho thấy sau quá trình thủy phân protein bởi enzyme Alcalase hàm lượng protein giảm từ 43,49% xuống 15,09%. Trong nghiên cứu này sử dụng enzyme Alcalase là một protease kiềm. Alcalase sẽ xúc tác cho phản ứng phân cắt các liên kết peptit trong phân tử protein tạo thành các axit amin hòa tan trong nước và các axit amin này sẽ được tách ra khỏi vỏ tôm trong quá trình tách dịch thủy phân. Do đó mà làm giảm lượng protein trong vỏ tôm. Bên cạnh đó có thể tận dụng dịch thủy phân protein làm thức ăn cho gia súc.
Quá trình lên men bởi L.Plantarum NCDN4 hàm lượng protein giảm từ 15,09% xuống 7,98%, hiện tượng này là do quá trình lên men sản sinh axit lactic khử khoáng đồng thời cũng làm mềm liên kết protein và chitin tạo điều kiện cho một số protease hoạt động làm thúc đẩy quá trình thủy phân (Bower và Hietala, 2008).
4.2.2. Kết quả nghiên cứu công đoạn khử khoáng
Trong vỏ các loài giáp xác chitin liên kết với protein và khoáng theo từng lớp tạo nên độ chắc cho lớp vỏ. Quá trình loại bỏ khoáng, chủ yếu là các muối canxi được thực hiện trong môi trường axit. Trong quy trình sản xuất chitin truyền thống, quá trình tách khoáng chỉ tiến hành một giai đoạn, lượng khoáng trong vỏ được loại bỏ dưới tác dụng của axit clohydric (HCl) ở nồng độ cao, hiệu quả tách khoáng khá cao tuy nhiên chất lượng chitin bị ảnh hưởng đáng kể [6]. Mặt khác, khi sử dụng axit HCl còn tạo ra nguồn nước thải có hại.
Trong nghiên cứu này sử dụng L.Plantarum NCDN4 lên men (sinh axit lactic) để khử khoáng trong điều kiện như sau :
- pH dịch lên men: 6
- Tỷ lệ rỉ đường: 20% (v/w) - Tỷ lệ giống: 20% (v/w) - Thời gian lên men: 4 ngày
Kết thúc quá trình lên men đem lọc và rửa bã, sấy đến khối lượng không đổi. Hàm lượng khoáng được xác định bằng phương pháp nung được trình bày trong mục 3.4.1.3. Kết quả phân tích được trình bày trong bảng 4.3
Bảng 4.3 : Hàm lượng khoáng còn sót lại trong vỏ tôm sau khử khoáng Mẫu Hàm lượng tro/chất khô tổng số (%)
Nguyên liệu 27,47
Sau khử khoáng 10,44
Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng L.Plantarum NCDN4 để khử khoáng không làm giảm phẩm chất của chitin, bên cạnh đó còn khắc phục được các hạn chế so với việc khử khoáng bằng axit vô cơ mạnh, tiết kiệm năng lượng vì chế độ khử khoáng ở nhiệt độ thấp (300C). Trong khi một số quy trình sử dụng HCl khác cần nhiệt độ cao cụ thể là “quy trình thủy nhiệt Yamasaky và Nacamichi, Nhật Bản” ở nhiệt độ 1200C.
4.2.3. Kết quả xác định màu của phế liệu tôm sau quá trình khử khoáng và khử protein
Hình 4.1 : PLT ban đầu Hình 4.2 : PLT sau thủy phân
Hình 4.3: Sản phẩm chitin sau lên men
Màu sắc của chitin/chitosan cũng là một yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng của chitin/chitosan.
Nhìn vào hình 4.1 cho thấy màu sắc PLT ban đầu có màu nâu đỏ, từ hình 4.2 và hình 4.3 ta thấy khi thủy phân protein bởi enzyme Alcalase và quá trình lên men khử khoáng bởi L.Plantarum NCDN4 màu sắc của PLT được cải thiện đáng kể, lúc đầu PLT có màu nâu đỏ sau đó chuyển dần sang màu hồng, sau quá trình khử khoáng ta thu được chitin có màu trắng phớt hồng.
Hiện tượng này là do lớp vỏ cứng bên ngoài vỏ tôm có chứa chất màu chủ yếu là astaxanthin, xuất hiện dưới dạng phức chất với các chất vô cơ cũng như protein. Vì vậy khử khoáng và khử protein có thể loại bỏ được chất màu.
4.2.4. Kết quả nghiên cứu công đoạn deacetyl hóa
Sau quá trình khử protein và khử khoáng ta thu được chitin, rửa chitin tới khi nước rửa có pH = 7. Tiến hành deacetyl chitin bằng NaOH 40% ở nhiệt độ 121oC trong khoảng 40 phút với thời gian tăng nhiệt và hạ nhiệt tổng là 3h, tỉ lệ NaOH 40%/bã chitin là 10/1. Deacetyl hóa chitin ta thu được chitosan đem rửa bằng nước đến khi pH nước rửa bằng 7, sấy chitosan đến khô (50oC, 24h) thu được chitosan thô. Xác định độ deacetyl hóa của chitosan theo phương pháp đo quang (OD) được trình bày trong mục 3.4.3.1. Kết quả thể hiện trên bảng 4.4.
Bảng 4.4: Kết quả xác định độ DDA của chitosan
Mẫu DDA (%)
Chitosan 93
Kết quả bảng 4.4 cho thấy độ DDA của chitosan >90%, như vậy dự đoán khả năng kháng khuẩn tốt của chế phẩm này. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của tác giả Trang Sỹ Trung [9].
4.2.5. Kết quả nghiên cứu công đoạn tinh sạch chitosan
Quá trình tinh sạch chitosan được thực hiện theo hai phương pháp:
Phương pháp 1: Sấy đối lưu
Chitosan thô ngâm trong nước ở nhiệt độ thường, sau đó hòa tan hoàn toàn vào dung dịch acid acetic 1%, tiến hành lọc để loại bỏ tạp chất; dung dịch sau khi lọc được kết tủa bằng NaOH 10%, pH = 8; kết tủa thu được rửa trung tính, đem ly tâm 9000 vòng/phút thu chitosan kết tủa , tiến hành sấy kết
tủa bằng phương pháp sấy đối lưu trong tủ sấy (nhiệt độ 50oC trong 1 ngày) thu được chitosan CA1.
Phương pháp 2: sấy đông khô
Chitosan thô ngâm trong nước ở nhiệt độ 800C, sau đó hòa tan hoàn toàn vào dung dịch acid acetic 1%, tiến hành lọc để loại bỏ tạp chất; dung dịch sau khi lọc được kết tủa bằng NaOH 10%, pH = 8; kết tủa thu được rửa trung tính, đem ly tâm 9000 vòng/phút thu chitosan kết tủa , tiến hành sấy kết tủa bằng phương pháp sấy đông khô (nhiệt độ -20oC trong 1 ngày) thu được chitosan CA2.
Chitosan sau tinh sạch được đem xác định độ DDA, độ nhớt, tính chất cảm quan. Kết quả thể hiện trên bảng 4.5, hình 4.4 và hình 4.5.
Bảng 4.5: Tính chất của chitosan sau tinh sạch Tính chất
Mẫu DDA (%) Độ nhớt
(cps)
Tính chất cảm quan
Hiệu suất thu hồi (%) Chitosan thô 92,8 1430 Trắng đục, hình
vảy, giòn
Chitosan CA1 93 1358 Trắng, cứng
giòn
99,5 Chitosan CA2 93,3 1003 Trắng, mềm xốp 99,46
Hình 4.4: Chitosan sấy đối lưu Hình 4.5: Chitosan sấy đông khô Kết quả nghiên cứu cho thấy sau quá trình tinh sạch chitosan có màu trắng sáng hơn so với chitosan thô, loại bỏ được phần chất không tan (chủ yếu là chitin do quá trình deacetyl không đạt độ đồng nhất cao). Độ DDA không
thay đổi đáng kể so với chitosan thô ban đầu. Độ nhớt giảm đáng kể sovới chitosan thô ban đầu. Điều này có thể giải thích là do chitosan được cấu tạo bởi các liên kết β-(1,4)-glucozit, liên kết này dễ bị cắt đứt bởi các tác nhân axit, kiềm, mà trong quá trình tinh sạch có sử dụng hai tác nhân này để tinh sạch. Hiệu suất thu hồi chitosan lớn.