CHƯƠNG 5: ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ
5.14. Sắc ký lỏng cao áp
- Áp dụng cho phân tích mẫu dạng lỏng, rắn có TLPT M>2000.
TS. Nguyễn Văn Sơn- Khoa CN Thanh Hóa-ĐHCN TP HỒ Chí Minh 81
Hình 5.17. Sơ đồ nguyên tắc cho máy sắc ký lỏng cao páp Các thành phần chính của máy sắc ký lỏng cao áp.
*) Bình chứa dung môi
Thường làm bằng thuỷ tinh, đôi khi làm bằng thép không rỉ, trong phương pháp rửa giải thông thường chỉ cần một bình chứa dung môi, trong phương pháp rửa giải gradient thường dùng 2, 3, 4 bình chứa các dung môi khác nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp của các loại dung môi trên trộn lẫn với nhau theo ti lệ đã được xác định. Cần loại các hạt và các khí hoà tan trong dung môi.
*) Hệ thống bơm
Bơm dùng trong phương pháp phải tạo được áp suất cao (3000 - 6000 psi hay khoảng 250 -500at), lưu lượng bơm khoảng 0,1 đến 10 ml/ph, phải trơ với các dung môi. Hệ thống bơm này phải có khả năng bơm pha động qua cột ở áp suất cao mà không bị ngắt quãng hoặc tạo nhịp sóng có thể làm sai lệch các lực thu được. Có nhiều kiểu bơm đã dùng trong các máy HPLC; nhưng kiểu phông xoay chiều hiện nay được dùng phổ biến nhất.
*) Hệ bơm mẫu (hệ tiêm mẫu)
Mẫu được bơm vào cột nhờ hệ thống van mẫu. Người ta bơm mẫu vào vòng mẫu với thể tích thường là từ 10 đến 20 μl.
*) Cột sắc ký
Kiểu cột thường phụ thuộc vào phương pháp dùng để tách, nhưng thường là những cột bằng thép không gỉ, có cỡ lỗ chính xác đường kính từ 3 đến 4 túm và dài từ 10 đến 30cm (những cột dùng cho SEC đường rộng hơn và dài đến 100cm). Loại cột này có hiệu lực rất cao, có số (ra lý thuyết lên đến 100.000 đĩa cho 1m chiều dài cột)
*) Detector
TS. Nguyễn Văn Sơn- Khoa CN Thanh Hóa-ĐHCN TP HỒ Chí Minh 82
sắc ký đồ. Hiện đang sử dụng các loại detector sau: Detector tử ngoại (UV): Dùng đèn thuỷ ngân cho vạch 254nm. Nhiều chất hấp thụ ở bước sóng này.
Detector tử ngoại và khả kiến (UV-VIS): Dùng phổ quang kế lựa chọn bước sóng từ 195 đến 750 nm. Loại này hiện nay được dùng nhiều nhất.
Detector điện hoá và detector huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao dùng trong phân tích vết. Dùng detector điện hoá có thể phát hiện được những lượng picrogam (10- 12g)
5.14.1. Các phương pháp sắc ký lỏng hiệu lực cao.
a. Sắc ký phân bố hiệu năng cao: Gồm hai loại: sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết.
* Sắc ký lỏng - lỏng: Pha tĩnh là chất lỏng được hấp phụ (bão hòa - bao) trên bề mặt chất mang (support), pha động là dung dịch chứa chất tan (cần tách qua cột), pha tĩnh thường bị dung môi hòa tan dần.
* Sắc ký pha liên kết: Pha tĩnh được gắn hóa học (liên kết với chất mang) tạo nên HC cơ siloxan
- Nếu R là nhóm dung môi ít phân cực như octyl (C8) octadecyl (C18)hay phenyl (C6H5) và dung môi phân cực như methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo.
- Nếu R là nhóm khá phân cực như ankyl amin-(CH2)n-NH2 hay ankylnitril ta có sắc ký pha thuận.
* Ứng dụng của sắc ký phân bố hiệu năng cao để tách các chất thuộc nhiều lĩnh vực:
thuốc kháng sinh, thuốc an thần, thuốc giảm đau.
b. Sắc ký hấp thụ hiệu năng cao: chất tan bị giữ lại trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ và bị dung môi đẩy ra (phản ứng hấp phụ).
- Pha tĩnh là những bột mịn silicagel và Al2O3 - Pha động là các dung môi hữu cơ: hexen, heptan.
- Ứng dụng: Để tách các chất ít phân cực, các chất hữu cơ không tan trong nước.
c. Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao.
* Nhựa trao đổi lớn là hợp chất cao phân tử có chứa nhóm chức có khả năng trao đổi.
Phân thành hai loại: cationít vào anionit: cationit axít mạnh (HSO3 - ) và được dùng rộng rãi, cationit axít yếu - COOH. Anionit bazơ mạnh có nhóm quan bậc 4 - N(CH3)3+ , OH- và anionít bazơ yếu có nhóm amin bậc 2 hoặc bậc 3.
TS. Nguyễn Văn Sơn- Khoa CN Thanh Hóa-ĐHCN TP HỒ Chí Minh 83
hoặc thuận nghịch.
- Với cationít:
- Với anionit.
* Dung lượng trao đổi đặc trưng cho khả năng trao đổi của ion chất tan với 1g ionít.
Nó phụ thuộc vào bản chất chất hấp phụ, dung môi và nhiệt độ.
So Sánh Giữa 2 Kỹ Thuật Sắc Ký Lỏng Cao Áp (HPLC) và Sắc Ký Khí (GC) - Độ bay hơi
+ HPLC: Không yêu cầu bay hơi, mẫu phải tan được trong pha động + GC: Mẫu phải bay hơi được
- Độ phân cực
+ HPLC: Tách được cả 2 loại hợp chất phân cực và không phân cực
TS. Nguyễn Văn Sơn- Khoa CN Thanh Hóa-ĐHCN TP HỒ Chí Minh 84
- Độ bền nhiệt
+ HPLC: Phép phân tích được thực hiện tại nhiệt độ thấp (nhiệt độ phòng hay thấp hơn) + GC: Mẫu buộc phải tồn tại ở nhiệt độ cao (nhiệt độ tách của cột và buồng tiêm mẫu) - Khối lượng phân tử
+ HPLC: Không có giới hạn trên về mặt lý thuyết, trên thực tế độ hoà tan là giới hạn + GC: Đặc trưng < 500 amu
- Chuẩn bị mẫu
+ HPLC: Mẫu buộc phải lọc, mẫu nên có dung môi hoà tan như pha động + GC: Dung môi phải bay hơi và có nhiệt độ sôi thấp hơn các chất phân tích - Lượng mẫu
+ HPLC: Lượng mẫu phụ thuộc vào đường kính (trong) của cột + GC: Thường từ 1 –5 μl
- Cơ chế tách
+ HPLC: Thực hiện ở cả 2 pha động và tĩnh + GC: Chỉ có pha động là mang mẫu
- Detecter – Đầu dò
+ HPLC: Thông dụng nhất là UV-VIS
+ GC: Thông dụng là FID, dùng cho phân tích các chất hữu cơ
* Ứng dụng: để tách các chất hữu cơ và vô cơ.
Sắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trên thế giới. Việt Nam tiếp cận kỹ thuật này vào những năm của thập niên 80. Vì điều kiện cuộc sống ngày càng cao, nên đòi hỏi phải có những công nghệ kỹ thuật hiện đại để đáp ứng nhu cầu.
Bên cạnh đó cũng có một số ít người, vì lợi nhuận cá nhân mà bất chấp tất cả. Ngày nay, để kiểm soát kiểm tra tình hình chất lượng hàng hoá để đáp ứng nhu cầu cuộc sống như:
thực phẩm, dược phẩm, hoá chất… Vì thế kỹ thuật sắc ký càng có vai trò lớn trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng mà kỹ thuật này hoàn toàn đảm đương được nhưng yêu cầu trên. Ví dụ như: kiểm tra dư lượng kháng sinh (nitrofuran, tetracycline…) trong thuỷ sản, kiểm tra dư lượng hoocmon (clenbuterol, salbutamol…) kích thích tăng trưởng, tạo nạc cho gia súc, kiểm tra dư lượng màu đã bị cấm có trong thực phẩm và mỹ phẩm như:
Sudan có trong trứng gia cầm và trong son môi, 3 MCPD (3_monoclo_propan_1,2_diol) có trong nước tương, formone có trong bánh phở, xác định một số phương pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ sự phát triển của các nấm mốc gây độc (có độc tố Aflatoxin) trong các lô hàng nông sản dự trữ và xuất khẩu đặc biệt đậu tương và lạc …
Trong công nghiệp dược phẩm, sơn: Kiểm tra hàm lượng hoạt chất chính trong dược phẩm, dư luợng chất có thể gây độc hại… Ngoài ra còn ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
TS. Nguyễn Văn Sơn- Khoa CN Thanh Hóa-ĐHCN TP HỒ Chí Minh 85
khác như quan trắc, môi trường… Vì vậy, với từng mục đích sử dụng mà ta có thể chọn một phương pháp sắc ký phù hợp để phân tích mẫu tương ứng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1) Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập chất hữu cơ, NXB ĐHQGTPHCM, 2007, Trang 151-451.
2) Trần Nhật Phương, Học phần kỹ thuật Công Nghệ Sinh Học- Proteomic/Sắc ký, 2008, 12 trang.
3) Nguyễn Tuấn Anh, Đỗ Thị Lan, Nguyễn Thế Hùng, Giáo trình phân tích môi trường, ĐH Nông Lâm Thái Nguyên, trang 49-59.
4) Sắc ký giấy:
http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/paper.html
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/C/Chromatography_paper.html http://en.wikipedia.org/wiki/file:cromatography_tank.png
http://peer.tamu.edu/podium_poster_presentations/Paper% 20Chromatography.ppt 5) Sắc ký lớp mỏng:
Piia Salo, Thin-Layer Chromatography with Ultravioletand Mass Spectrometric Detection:
From Preparative-Layer to Miniaturized Ultra-Thin-Layer Technique ,Division of Pharmaceutical Chemistry Faculty of Pharmacy University of Helsinki, Finland.
http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_US&cid=10048919
http://www.chromatography-online.org/Principles/TLC-Apparatus/Chambers.html 6) Sắc ký cột:
http://en.wikipedia.org/wiki/Column_chromatography 7) Sắc ký trao đổi ion:
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/ResourceC enter/PrinciplesofChromatography/IonExchange/
8) Sắc ký gel:
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/ResourceC enter/PrinciplesofChromatography/SizeExclusion/
9) Sắc ký tương tác kỵ nước:
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/ResourceC enter/PrinciplesofChromatography/HydrophobicInteraction/
10) Sắc ký ái lực:
http://fachschaft.biochemtech.uni-halle.de/downloads/chromatography/affchr.pdf
TS. Nguyễn Văn Sơn- Khoa CN Thanh Hóa-ĐHCN TP HỒ Chí Minh 86
enter/PrinciplesofChromatography/Affinity/
11) Sắc ký khí:
http://en.wikipedia.org/wiki/Gas-liquid_chromatography
http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gaschrm.htm http://www.chemistry.nmsu.edu/Instrumentation/GC_MS.html
12) Sắc ký lỏng cao áp:
http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc/hplc.htm