4.1.1. Hai hợp chất auronol glucoside maesopsin-4-O-β-D- glucopyranoside (116) và alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125)
* Hai hợp chất auronol glucoside 116 và 125
Các số liệu phổ của chất 116 và 125 cho các tín hiệu phù hợp với cấu trúc phân tử và các dữ liệu phổ đã được công bố 1.
* Điều chế auronol maesopsin
Thủy phân 116 sạch (5 g) bằng HCl loãng ở điều kiện đun hồi lưu nhẹ trong methanol thu được maesopsin với hiệu suất 75%.
Phổ NMR của auronol 98 cho các tín hiệu của các proton và carbon khung auronol và không còn các tín hiệu của phần đường và ta cũng không thấy xuất hiện các tín hiệu kép trong phổ NMR của nó. Ở vùng trường thơm, phổ 1H-NMR cho 2 cặp doublet ở H 7,01 (H-2′, H-6′) và 6,59 (H-3′, H-5′) với hằng số tương tác Jortho = 8,5 Hz, ở trường cao hơn là 2 tín hiệu singlet tù ở H 5,78 (1H, H-5) và 5,74 (1H, H-7). Phổ 13C- NMR cho 15 tín hiệu của 15 carbon khung auronol: gồm 12 carbon thơm 2 vòng A và B, trong đó 4 tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết với oxy ở C 173,9 (C-8), 171,0 (C-6), 159,9 (C-4), 157,2 (C-4′); 6 tín hiệu của 6 carbon methine thơm ở C 132,5 (C-2′, C-6′), 115,7 (C-3′, C-5′) và ở C 96,8 , 91,1 (C-5, C-7), 2 tín hiệu của carbon thơm bậc 4 ở C 125,9 (C-1′) và 103,1 (C-9); 2 tín hiệu của carbon vòng C ở C 196,8 (3-C=O) và một carbon hemicetal ở C 107,0 (C-2); ngoài ra ở trường cao là tín hiệu của carbon methylene C-10 ở C 42,1. Phổ HSQC cho các tương tác C-H trực tiếp và HMBC cho các tương tác xa của proton CH2-10 (3,08 ppm)/C-2 (107,0 ppm)/C-1′(125,9 ppm)/C-2′,6′ (132,5 ppm)/C-3 (196,8 ppm), cùng với độ chuyển dịch thấp bất thường của carbon C-8 (173,9 ppm) do ảnh hưởng sức căng vòng 5 (vòng C) đã chứng minh
1 T. T. Thuy, C. Kamperdick, P.T. Ninh, T. P. Lien, T. T. P. Thao, T. V. Sung, “Immunosuppressive auronol glycosides from Artocarpus tonkinensis”, Pharmazie, 2004, 59 (4), 297-300.
Footer Page 20 of 148.
19
cấu trúc khung auronol của chất 98. Phổ khối ESI-MS của chất 98 cho pic ion âm giả phân tử m/z = 287 [M-H]ˉ phù hợp với số khối công thức phân tử C15H12O6.
4.1.2. Bán tổng hợp alphitonin
* Phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh (Smilax glabra Wall ex Roxb.)
Với mục tiêu tìm nguồn nguyên liệu cho việc xây dựng quy trình tổng hợp các hợp chất auronol chúng tôi đã khảo sát một số tỉnh, thành phố ở miền Bắc và Thổ phục linh của Trung Quốc bán tại phố Lãn Ông Hà Nội. Kết quả khảo sát hàm lượng tách được của astilbin cho thấy hàm lượng astilbin trong rễ Thổ phục linh Việt Nam tại các tỉnh là khá cao từ 0,8-1,1% so với trọng lượng mẫu củ khô (trừ vùng Sơn La 0,74%) và cao hơn hẳn so với hàm lượng astilbin trong rễ Thổ phục linh Trung Quốc đang bán tại Hà Nội (0,3%). Chúng tôi cũng sơ bộ khảo sát trữ lượng tại các vùng lấy mẫu cho thấy Tuyên Quang và Hà giang là 2 tỉnh vẫn còn khả năng thu mua với lượng lớn Thổ phục linh. Kết quả thu được là cơ sở cho việc khai thác và sử dụng nguồn dược liệu quý này ở nước ta.
Từ 10 kg mẫu rễ thổ phục linh khô thu tại Tuyên Quang chúng tôi đã phân lập 100 g astilbin sạch (95%) cung cấp nguồn nguyên liệu cho điều chế auronol alphitonin
* Điều chế taxifolin từ astilbin
Taxifolin (C15H22O7, 81) thu được từ sự thủy phân của astilbin là nguồn nguyên liệu cho việc nghiên cứu bán tổng hợp alphitonin. Từ astilbin tương đối sạch đạt trên 95% đã được thủy phân bằng HCl/MeOH theo phương pháp thông thường. Sản phẩm thủy phân đã được phân lập kết hợp SKC và kết tinh thu được taxifolin sạch. Cấu trúc của sản phẩm đã được xác định bằng các phương pháp phổ phù hợp với cấu trúc phân tử và các dữ liệu phổ của taxifolin đã được công bố.
* Phản ứng đồng phân hóa taxifolin cho alphitonin
Chúng tôi đã khảo sát các điều kiện về nhiệt độ, dung môi và thời gian ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng đồng phân hóa taxifolin.
Footer Page 21 of 148.
20
Kết quả cho thấy phản ứng đồng phân hóa taxifolin cho hiệu suất cao ổn định ở điều kiện dung môi là 1mmol taxifolin/7ml H2O với thời gian phản ứng là 95 giờ ở nhiệt độ dầu cấp nhiệt là 155oC, hiệu suất alphitonin đạt 65%. Kết quả này rất hữu ích cho việc nghiên cứu bán tổng hợp alphitonin từ taxifolin ở lượng cân lớn đáp ứng các nhu cầu nghiên cứu chuyển hóa và thử hoạt tính tiếp theo của alphitonin.
Tương tự như maesopsin (98), phổ NMR của hợp chất 82 cho các tín hiệu của các proton và carbon khung auronol, các số liệu phổ phù hợp với cấu trúc phân tử và với các số liệu đã được công bố 2,3. Đặc biệt tín hiệu tù và thấp của các nhóm OH ở δH 9,65, 7,70 và 7,66 ppm, chứng tỏ nhóm này không tạo cầu với nhóm 3-C=O. Phổ khối ion hóa phun mù điện tử cho pic ion phân tử đề proton hóa [M-H]ˉ với m/z = 303 phù hợp với công thức phân tử C15H12O7.
4.1.3. Tổng hợp toàn phần các auronol alphitonin và maesopsin Qua việc đánh giá phân tích các phương pháp tổng hợp toàn phần của auronol đã công bố chúng tôi đã lựa chọn tổng hợp auronol qua 2 giai đoạn: Giai đoạn 1 là tổng hợp các aurone; Giai đoạn 2 là khử nối đôi của aurone rồi tiến hành oxy hóa để thu được sản phẩm aurone đã được hydrate hóa là các auronol.
* Nghiên cứu phương pháp tổng hợp các aurone
Các aurone có thể được tổng hợp theo nhiều phương pháp như ngưng tụ các benzofuranone với các benzaldehyde hoặc từ đóng vòng các chalcone hoặc sử dụng xúc tác cho sự đóng vòng ketone... Trong đó, phương pháp ngưng tụ giữa các benzofuranone với các benzaldehyde là phương pháp phổ biến, vì vậy chúng tôi đã nghiên cứu tổng hợp các aurone theo phương pháp này đi từ các nguyên liệu sẵn có thương mại. Bước quan trọng trong tổng hợp aurone theo phương pháp
2Paul W. Elsinghorst, Taner Cavlar, Anna Muller, Annett Braune, Michael Blaut, and Michael Gutschow,
"The Thermal and Enzymatic Taxifolin−Alphitonin Rearrangement", J. Nat. Prod., 2011, 74, 2243−2249.
3E. Kiehlmann et al., “Isomerization of dihydroquercetin”, J. Nat. Prod., 1995, 58 (3), 450-455.
Footer Page 22 of 148.
21
này là việc chuẩn bị chất chìa khóa trung gian benzofuranone. Tổng hợp 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (5b) gồm 2 bước chính. Bước đầu tiên là phản ứng ngưng tụ giữa phloroglucinol và chloroacetonitrile trong sự có mặt của ZnCl2, khí HCl tạo nên muối iminium (3) (42%).
Muối 3 sau đó được thủy phân đóng vòng để tạo 5b. Phản ứng thủy phân đóng vòng được tiến hành theo 2 phương pháp. Đó là, thủy phân trong môi trường acid HCl, đun hồi lưu và đóng vòng bởi MeONa cho 5b với hiệu suất 46% toàn phần. Sản phẩm 5b cũng thu được 41% sản lượng từ 3 chỉ bằng cách đơn giản hơn là đun hồi lưu trong nước. Như vậy, cả hai phương pháp đều cho kết quả tương ứng nhau. Tuy nhiên, phương pháp nhiệt phân trong nước ít tốn chi phí và dễ thực hiện hơn phương pháp đầu. Phản ứng ngưng tụ benzofuran-3-one và dẫn xuất benzaldehyde có thể tiến hành theo 2 cách, sử dụng hệ KOH/MeOH hoặc HCl/ MeOH. Cơ chế của phản ứng tùy thuộc vào sự có mặt của xúc tác acid hay base.
Cấu trúc của aurone tổng hợp 55, 90, 56, 117 đã được khẳng định bởi phân tích các phổ IR, ESI-MS và NMR, phù hợp với các tài liệu đã công bố. Trong các công bố trước đây đã chứng minh các sản phẩm ngưng tụ hay đóng vòng chalcone là các đồng phân (Z)-aurone vì ổn định hơn đồng phân (E)- tương ứng. Hai đồng phân này có thể phân biệt bởi sự khác biệt về độ chuyển dịch hóa học của các proton olefine trong phổ 1H-NMR ở δH 6,70 ppm cho đồng phân (Z)- và ở δH 7,00 ppm cho đồng phân (E)-. Độ chuyển dịch proton olefine của các aurone tổng hợp được (55, 90, 56, 117) ở trong khoảng 6,44- 6,72 ppm. Đồng thời phổ hồng ngoại FT-IR của các (Z)-aurone cũng cho những dải hấp thụ mạnh ở khoảng 1600 cm-1 trong khi những dải hấp thụ này yếu hoặc biến mất đối với (E)-aurone. Như vậy, các aurone tổng hợp ở dạng đồng phân (Z)-.
* Tổng hợp các auronol từ aurone
Các aurone 56, 117, 55, 90 được khử hóa bằng khí H2 với xúc tác Pd/C trong MeOH ở nhiệt độ phòng cho các dihydroaurrone 118, 119, 120, 91 tương ứng với hiệu suất cao. Cấu trúc của các dihydroaurone đã Footer Page 23 of 148.
22
được khẳng định bằng các phương pháp phổ. Các tín hiệu trên phổ của các dihydroaurone có sự thay đổi so với aurone tương ứng. Do mất nối đôi trong phân tử nên trên phổ NMR của các dihydroaurone xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm methylene CH2-10 và CH-2 ở vùng trường cao.
Các methoxydihydroaurone 120 và 91 bên cạnh việc ngưng tụ các methoxybenzofuranone với các methoxybenzaldehyde còn có thể thu được từ phản ứng methyl hóa các dihydrohydroxyaurone 118 và 119 với MeI với xúc tác K2CO3.
Phản ứng chuyển hóa aurone trực tiếp về auronol đã được quan tâm nghiên cứu nhiều nhưng không thành công do khả năng dễ dehydrate auronol trở lại aurone dưới điều kiện acid. Vì vậy, để hydrate hóa các aurone phải đi theo con đường vòng qua 2 bước chính: Bước 1 từ dihydroaurone hình thành silyl enol ether, sử dụng base LDA trong THF; Bước 2 tiến hành oxy hóa silyl enol ether theo Rubottom sử dụng m-chloroperbenzoic acid (m-CPBA) trong CH2Cl2 ở 0oC sau đó tách loại nhóm TMS bởi tetrabutylamonium fluoride (TBAF) thu được các auronol 122 và 93.
4.1.4. Tổng hợp auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D- glucopyranoside
Auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) được tổng hợp gồm 2 bước: Bước 1 là glucoside hóa auronol sử dụng tác nhân 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl bromide; bước 2 là loại các nhóm bảo vệ acetyl trong phần đường để thu auronol glucoside.
Phản ứng glucosyl hóa alphitonin (82) với acetyl glycopyranosyl bromide đã được thử nghiệm với các xúc tiến khác nhau như ZnCl2, CdCO3, HgI2 hoặc Ag2CO3 kết hợp với xúc tác base K2CO3. Các kết quả thu được cho thấy ở các thử nghiệm này thì sản phẩm trung gian alphitonin-4-O-β-D-tetraacetyl glucopyranoside (124) đã không được phát hiện. Sản phẩm glucoside hóa (chất 124) được hình thành với sự kết hợp của hỗn hợp K2CO3/Cs2CO3 đã đạt với hiệu suất 39%.
Cấu trúc của alphitonin-4-O-β-D-tetraacetyl-glucopyranoside được chứng minh bằng các phương pháp phổ. Trên phổ 1H-NMR của chất Footer Page 24 of 148.
23
124 ngoài các tín hiệu aglycone alphitonin ta thấy xuất hiện thêm các tín hiệu của phần đường: 5 tín hiệu proton methine ở δH 5,35 (t, J = 9,0 Hz), 5,32/5,22 (d, J = 8,0 Hz), 5,23 (dd, J = 8,0 , 9,0 Hz), 5,11 (m), và 4,09/4,02 (m); 2 tín hiệu proton methylene của CH2-6′′ ở 4,33/4,31(dd, J = 5,0 , 12,0 Hz) và 4,18/4,11 (dd, J = 1,7 , 12,0 Hz) và 4 tín hiệu singlet của các proton methyl của các nhóm acetyl ở 2,00- 2,10 ppm (4
× OAc). Tương tự phổ NMR của chất 116, chất 125, trên phổ NMR của chất 124 ta thường thấy các cặp tín hiệu kép. Hiện tượng này có thể do trung tâm bất đối C*-2 kết hợp với 4 trung tâm bất đối của phần đường tạo nên các diasteromer tách được trong từ trường đo nên xuất hiện các tín hiệu kép trong phổ NMR của chúng.
Hình 4.44. Phổ 1H-NMR của chất 124 (CD3OD)
Hình 4.45. Phổ HMBC của chất 124 (CD3OD) Footer Page 25 of 148.
24
Phản ứng glucosyl hóa chọn lọc tại C-4 được xác định rõ qua phân tích phổ NMR của hợp chất 124, đặc biệt là bằng phổ HSQC kết hợp với HMBC (hình 4.45) cho thấy các tương tác xa giữa CH2-10 (3,02 ppm)/C-2′ (118,8/118,7 ppm), C-6′ (123,1/122,9 ppm)/C-2 (107,4/107,1 ppm)/C-1′ (126,5 ppm)/C-3 (194,9 ppm). Ngoài ra, phổ HSQC, phổ HMBC cho ta thấy tương tác xa mạnh của proton anome H-1′′
(5,32/5,22 ppm)/C-4 (157,7/157,5) đã khẳng định phần đường gắn ở vị trí C-4 của khung auronol.
* Phản ứng deacetyl hóa hợp chất 124
Phản ứng thủy phân các nhóm acetyl của phần đường trong phân tử auronol glucoside là phản ứng thủy phân các ester sử dụng base (NaOH) thông thường. Các dữ liệu phổ NMR của alphitonin-4-O-β-D- glucopyranoside tổng hợp được là phù hợp với các tài liệu đã báo cáo.
Như vậy, alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside đã được tổng hợp từ taxifolin (81) với hiệu suất toàn phần 13,0%. Kết quả tổng hợp này cho phép cung cấp hợp chất auronol glucoside 125 lượng gam cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học của nó.
4.1.5. Tổng hợp một số dẫn xuất nitrile của alphitonin, maesopsin và maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside
Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất nitrile của các auronol được tiến hành trong môi trường kiềm ở nhiệt độ 0oC cho các sản phẩm thế 1 lần và 2 lần phụ thuộc vào tỉ lệ mol của chất nền và các tác nhân. Ở tỉ lệ mol của các tác nhân là auronol/chloroacetonitrile/NaOH (1/1,1/1,1;
mol/mol/mol) ta thu được sản phẩm 1 lần thế vào vị trí C-4 là chất 126 và 127. Khi tăng tỉ lệ mol của xúc tác base và chloroacetonitrile lên gấp hơn 2 lần lượng mol của chất phản ứng (82 hoặc 98) ta thu được sản phẩm thế 2 lần vào 2 vị trí C-4 và C-6 là chất 128 và 129 . Nếu ta tiếp tục tăng tỉ lệ mol của xúc tác base và chloroacetonitrile lên gấp hơn 3 hay 4 lần lượng mol của các auronol ta cũng chỉ thu được sản phẩm thế 2 lần vào 2 vị trí C-4 và C-6. Sự ưu tiên thế vào vị trí 4-OH và 6-OH có thể được giả thiết là do ảnh hưởng của nhóm C=O vòng C đã hoạt hóa Footer Page 26 of 148.
25
các nhóm 4-OH và 6-OH qua các nối đôi liên hợp vì thế khi lượng tác nhân phản ứng dư ta sẽ thu được các sản phẩm thế ở các vị trí này. Ở tỉ lệ mol của các tác nhân là auronol/chloroacetonitrile/NaOH (1/1,1/1,1;
mol/mol/mol) ta thu được sản phẩm 1 lần thế vào vị trí C-4 có thể do sự kết hợp của 2 hiệu ứng –C và –I của nhóm 3-C=O. Ngoài hiệu ứng –C, nhóm 3-C=O còn có hiệu ứng –I làm bền ion phenolate ở 4-C-Oˉ nên khả năng phản ứng nucleophine của nhóm này tạo sản phẩm ở C-4 thuận lợi hơn so với ở C-6 và cho ta sản phẩm ở C-4 trước. Kết quả thực nghiệm đã cho thấy phản ứng thế ưu tiên hơn vào vị trí C-4 một lần nữa chứng tỏ không có liên kết cầu hydro giữa nhóm 4-OH (vòng A) với nhóm 3-C=O (vòng C) như đã được khẳng định bởi tín hiệu rộng và thấp của các nhóm OH hai vòng A, B ở dưới 10 ppm trên phổ 1H- NMR của alphitonin. Kết quả thu được sản phẩm ưu tiên thế vào nhóm 4-OH của khung auronol rất thú vị nó đã chứng minh sự bắt gặp 2 auronol glucoside (chất 116, 125) với nhóm đường gắn vào vị trí C-4 trong tự nhiên.
Tổng hợp auronol glucoside 116 mang một nhóm nitrile 130 được tiến hành tương tự như đối với các auronol 82 và 98, phản ứng cho hiệu suất thấp hơn.
Cấu trúc của các sản phẩm đã được chứng minh bằng các phương pháp phổ. Phổ NMR của các hợp chất ngoài các tín hiệu của khung auronol / auronol glucoside còn cho thêm tín hiệu của các nhóm acetonitrile. Phổ khối ion hóa phun mù điện tử cho pic ion âm phân tử đề proton hóa [M-H]ˉ với m/z= 342 [M-H]ˉphù hợp với công thức phân tử C17H13NO7 (126); tương tự m/z = 326 [M-H]ˉ (C17H13NO6 127); m/z
= 381 [M-H]ˉ (C19H14N2O7 128); m/z = 365 [M-H]ˉ (C19H14N2O6 129) và chất 130 cho pic ion dương giả phân tử m/z = 512 [M+Na]+ phù hợp với công thức phân tử C23H23NO11. Đặcbiệt, trên phổ HMBC các tương tác xa của proton nhóm methylene (-OCH2CN) với carbon trong khung auronol cho biết vị trí của các nhóm thế gắn vào khung auronol như:
chất 126 [5,19 - 5,13 ppm (-OCH2CN)/155,5 ppm (C-4)]; chất 127 Footer Page 27 of 148.
26
[5,17 - 5,12 ppm (-OCH2CN)/155,5 ppm (C-4)]; chất 128 [5,19 - 5,12 ppm (OCH2CN)/157,0 ppm (C-4)/168,4 ppm (C-6)]; chất 129 [5,00 - 5,10 ppm (-OCH2CN)/157,0 ppm (C-4)/168,4 ppm (C-6)] và chất 130 [5,04 ppm (-OCH2CN)/ 168,8 ppm (C-6 ) và 4,98 - 4,96 ppm (H- 1′′)/158,1 - 158,0 ppm (C-4 )].