CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.4. Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào
1.4.3. Các điều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro
Môi trường nuôi cấy bao gồm hai loại: Môi trường hoá học và môi trường vật lý, chúng quyết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống in vitro.
Môi trường nuôi cấy
MT Hóa học
MT Vật lí
Nhóm các nhân
tố vi lƣợng
Các chất điều hòa
sinh trưởng
Các thành
phần khác
Nhiệt độ Nhóm
các nhân tố đa lƣợng
Ánh sáng Các
vitamin Nguồn
các bon Footer Page 24 of 126.
Do vậy, khi tiến hành nuôi cấy phải lựa chọn được môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở từng giai đoạn của quá trình nuôi cấy và với từng đối tượng nuôi cấy cụ thể:
* Môi trường hoá học: Cung cấp các chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho sự sinh trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro. Thành phần của môi trường hoá học thay đổi theo loài cây, bộ phận cây, mục đích nuôi cấy, nhưng thường có các nhóm chất sau:
- Nhóm các nguyên tố đa lượng
Nguyên tố đa lượng là những nguyên tố muối khoáng như: N, P, K, S, Mg và Ca, được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm. Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường và xây dựng nên thành tế bào. Môi trường nhiều Nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi, với môi trường nhiều Kali sẽ giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ.
- Nhóm các nguyên tố vi lượng
Nguyên tố vi lượng là những nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ dưới 30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Co, Mn, Bo,… Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy, nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của mô. Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất tái sinh thấp. Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào từng môi trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy.
- Nguồn cacbon
Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu, vì vậy buộc phải bổ sung nguồn cacbon để mẫu nuôi cấy có thể tổng hợp được các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia. Thông thường nguồn cacbon bổ sung là đường Sucrose và glucose với liều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
lượng 20 - 30g/l dung dịch. Trong trường hợp cần thiết có thể thay thế bằng các loại đường khác như: Maltose, lactose hay fructose.
- Các vitamin
Theo Czocowoki (1952) thì mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu của chúng. Vì vậy, phải bổ sung các vitamin cần thiết vào môi trường nuôi cấy để góp phần tạo các cô enzyme xúc tác các phản ứng sinh hoá trong tế bào [8]. Các vitamin thường được sử dụng như: B1 (Thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Axit panthotenic), B5
(Axit nicotinic), B6 (piridoxin) với nồng độ phổ biến là 1mg/l. Myo – inositol cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp thành tế bào thực vật.
- Các chất phụ gia hữu cơ
Các chất phụ gia được đưa và môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan như: nước dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men.
Trong thành phần của nước dừa chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, Myo - inositol và các chất có hoạt tính Auxin, các gluoxit của Cytokinin. Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được sử dụng, vì trong thành phần của chúng có chứa một số vitamin và các kích thích tố có tác dụng tích cực đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy.
- Các chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quả nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy. Nó ảnh hưởng tới sự biệt hoá, phản biệt hoá và sự sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ. Nhu cầu về chất điều hòa sinh trưởng đối với từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau. Vì vậy, để nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thể để tìm ra nồng độ cũng như tỷ lệ các chất điều hoà sinh trưởng phù hợp. Trong nuôi cấy mô - tế bào thường sử dụng 3 nhóm chất chính là Auxin, Cytokinin và Gibberellin.
+ Auxin: Tác dụng kích thích sự giãn tế bào, sự hình thành rễ bất định và mô sẹo.
Trong nuôi cấy mô tế bào thường sử dụng bốn loại Auxin là: IAA (Indol axetic axit), IBA (Indol butyric), NAA (Naphthyn axetic axit) và 2.4-D (2,4 dicloro phenoxy axetic axit), với nồng độ từ 0,1 - 5mg/l tuỳ từng loài cây, từng loại chất và từng giai đoạn nuôi cấy.
Footer Page 26 of 126.
+ Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào và hình thành chồi,các chất thường được sử dụng là: Kinetin và BAP (benzil amino purin). Tỉ lệ giữa Auxin và Cytokinin quy định sự biệt hoá của mô - tế bào theo hướng tạo chồi, tạo rễ hoặc hình thành mô sẹo. Theo những nghiên cứu của Milleer và Skoog cho thấy trong môi trường nuôi cấy nếu tỉ lệ Auxin/Cytokinin cao thì mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo rễ, nếu thấp mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo chồi, còn nếu tỉ lệ này gần bằng 1 thì mẫu nuôi cấy sẽ biệt hoá theo hướng tạo mô sẹo. Theo Das (1958) và Nistach (1968) cho rằng chỉ khi có tác dụng đồng thời của Auxin và Cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN dẫn đến quá trình phân chia tế bào.
+ Gibberellin: Đây là chất có tác dụng kích thích sự giãn tế bào, kéo dài lóng, đốt thân, cành cây. Ngoài ra, nó còn có tác dụng phá tính ngủ nghỉ ở củ, hạt, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ. Chất thường được sử dụng nhất trong nhóm này là GA3 (Gibberellin).
Ngoài ba nhóm chất trên còn có các chất có tác dụng ức chế sự sinh trưởng và phát triển khác như Etylen. Chất này cũng gây ảnh hưởng khá rõ đến sự phát sinh hình thái của một số cây trồng trong nuôi cấy in vitro [3], [5], [12], [13].
- Các chất làm đông cứng môi trường (giá thể)
Một số chất được sử dụng để làm môi trường nuôi cấy đông đặc lại để tạo thành giá thể cho mẫu cấy phát triển như Agar. Đây là một loại polysacharid làm từ rong biển và có khả năng ngậm nước cao, ở 800C agar ngậm nước và tồn tại ở trạng thái lỏng, còn ở dưới 400C nó lại tồn tại ở trạng thái rắn. Trong môi trường có tính axit cao Agar không có khả năng đông đặc, Agar thường được sử dụng ở nồng độ 6 – 10 g/l [13].
- Độ pH của môi trường: Là yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào mẫu cấy. Thực tế đã chứng minh khi pH thấp (pH< 4,5) hoặc cao (pH >7) đều gây ra ức chế sinh trưởng, phát triển của mô và tế bào nuôi cấy. Nếu pH của môi trường giảm mạnh sẽ làm rối loạn quá trình trao đổi Fe, làm giảm hay ngừng hẳn quá trình sinh trưởng của mẫu cấy, thường độ pH dao động trong khoảng từ 5,5 - 6,5 trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật.
* Môi trường vật lý:
Nhiệt độ và ánh sáng là hai nhân tố vật lý có ảnh hưởng cơ bản và quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Nhiệt độ: Là nhân tố vật lý quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất trong mô cấy, đồng thời nó ảnh hưởng tới sự hoạt động của Auxin do đó nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của cây mô. Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định ở 25 ± 20C.
- Ánh sáng: Các nghiên cứu đã cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nó phụ thuộc rất nhiều vào thời gian chiếu sáng, cường độ và chất lượng ánh sáng. Đặc biệt thời gian chiếu sáng phải phù hợp với đặc tính sinh vật học của loài cây và bộ phận nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thường biến động từ 8 - 16 giờ/ngày.
Cường độ ánh sáng có ảnh hưởng lớn tới quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo, cường độ thấp lại gây nên sự tạo chồi.
Ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2.000-3.000 Lux, tương đương với khoảng cách 30 cm từ đèn chiếu sáng tới mô nuôi cấy hoặc dùng ánh sáng tự nhiên với cường độ thấp là phù hợp với nuôi cấy in vitro. Trong nhiều trường hợp ở giai đoạn nuôi cấy tạo mô sẹo có thể không cần ánh sáng.
Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ tới kết quả nuôi cấy. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân, chồi hơn so với ánh sáng trắng. Ánh sáng xanh ức chế sự vươn cao, nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sinh trưởng của mô sẹo [12].
1.4.3.2. Vật liệu nuôi cấy
Về nguyên tắc mọi tế bào của mô chuyên hoá như: thân, rễ, lá, chồi… trên cơ thể sinh vật đều có khả năng làm vật liệu nuôi cấy. Tuy nhiên trong thực tế cho thấy tuỳ vào loại tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau, vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao. Khi chọn vật liệu nuôi cấy cần chú ý đến mùa vụ lấy vật liệu, kích thước vật liệu, tuổi cây mẹ, vị trí lấy vật liệu trên cây mẹ và dòng cây mẹ [13].
1.4.3.3. Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định đến sự thành bại của quá trình nuôi cấy in vitro. Do môi trường nuôi cấy rất giàu dinh dưỡng nên nó sẽ là môi trường phát triển hết sức thuận lợi cho nấm và các vi sinh vật khác. Nếu điều kiện vô trùng không
Footer Page 28 of 126.
được đảm bảo thì mẫu cấy sẽ bị tạp nhiễm và chết dẫn đến các giai đoạn sau bị ngừng lại. Vì vậy, trong quá trình nuôi cấy phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối hay là phải có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng cấy, bàn cấy vô trùng, đặc biệt các thao tác nuôi cấy phải hết sức cẩn thận [13].