CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Các nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu: phải chia thành các công thức thí nghiệm khác nhau, phải có công thức đối chứng.
- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu: phải bảo đảm tính đồng nhất giữa các công thức thí nghiệm.
- Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥ 30) - Thí nghiệm được lặp lại ≥ 3 lần.
2.2.2. Phương pháp thực nghiệm
Sử dụng hạt làm nguồn vật liệu khởi đầu, tiến hành khử trùng và cấy vào môi trường MS cơ bản. Khi mẫu tái sinh và bật chồi, sau 2-3 tuần cắt cây mầm và cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng để nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi. Khi các chồi dài khoảng 3-5 cm thì tiến hành cắt và cấy chuyển sang môi trường kích thích tạo rễ, những chồi không đủ kích thước thì tiếp tục cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh.
Các môi trường thí nghiệm được chỉnh pH đến 5,8 sau đó khử trùng ở 120oC trong thời gian 20 phút.
Các mẫu cấy được nuôi ở điều kiện ánh sáng trắng 12 giờ/ngày, cường độ 3.000 lux, nhiệt độ 25-27 oC .
Đề tài tiến hành 7 thí nghiệm với các phương pháp bố trí thí nghiệm như sau:
2.2.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro
Có nhiều hóa chất được sử dụng để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ nguồn bệnh và tạo được lượng lớn các mẫu sạch in vitro, nhưng hai loại hóa chất được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả cao là HgCl2 và NaClO.
Phương pháp khử trùng:
Khử trùng ngoài box cấy: Hạt cây Chùm Ngây được tách bỏ vỏ ngoài, loại bỏ hạt xấu, chọn hạt đồng đều. Hạt được đựng trong ống phancol, lắc rửa mạnh bằng nước sạch và dung dịch nước xà phòng để loại bỏ chất bẩn bám trên bề mặt. Sau đó rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy sao cho hết xà phòng, tráng lại mẫu bằng nước cất sạch.
Footer Page 32 of 126.
Khử trùng trong box cấy: Hạt được rửa bằng nước cất vô trùng, lắc mạnh trong 1-2 phút để loại bỏ các chất bẩn bám trên bề mặt, lặp lại 3 lần. Sau đó tiến hành rửa bằng cồn 70% trong 2 phút rồi rửa sạch bằng nước cất vô trùng (rửa 3 lần). Sử dụng hóa chất HgCl2 0,1% hoặc NaClO 60% với thời gian khử trùng khác nhau, sau đó rửa lại 4-5 lần bằng nước cất vô trùng để loại bỏ hóa chất bám trên bề mặt tránh gây độc cho phôi hạt.
Cấy mẫu vào môi trường: Hạt sau khi xử lý được đưa ra đĩa vô trùng, dùng giấy thấm vô trùng để thấm khô nước trên bề mặt của hạt, sau đó cấy lên môi trường: MS + 8g/l Agar + 30g/l sucrose. Thí nghiệm được bố trí như ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Công thức
Hóa chất Thời gian (phút)
Tổng số mẫu
cấy (mẫu)
Mẫu sạch Mẫu sạch tái sinh Thời gian mẫu nẩy
mầm (ngày) Số mẫu
sạch (mẫu)
Tỷ lệ mẫu sạch (%)
Số mẫu sạch nẩy
mầm
Tỷ lệ mẫu sạch nẩy mầm (%)
KT1
HgCl2 0,1%
4 30
KT2 6 30
KT3 8 30
KT4
Javen 60%
(NaClO)
6 30
KT5 12 30
KT6 18 30
2.2.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro
Trong nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, môi trường dinh dưỡng được xem là nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả nhân giống. Môi trường dinh dưỡng cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và phân hóa của các mô trong suốt quá trình nuôi cấy. Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định được môi trường dinh dưỡng phù hợp với từng đối tượng cây trồng ở từng giai đoạn cụ thể trong quy trình nuôi cấy là việc rất cần thiết, để đạt được hiệu quả nuôi cấy cao nhất. Trong thí nghiệm này, sử dụng chồi của cây mầm in vitro để cấy vào các loại môi trường dinh dưỡng cơ bản khác nhau, gồm: Mụi trường MS, ẵ MS, WPM, B5 Gamborg và Chu (N6), cỏc loại mụi trường này đều được bổ sung 0,5 mg/l BAP + 8 g/l agar + 30 g/l đường sucrose, nhằm xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro. Thí nghiệm được bố trí trong bảng 2.2.
Footer Page 34 of 126.
Bảng 2.2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro
Công thức
thí nghiệm Môi trường
dinh dƣỡng
Tổng số mẫu cấy ban đầu (chồi)
Số mẫu tái sinh
chồi
Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%)
Số chồi
TB/mẫu Chất lƣợng
chồi
MT1 ẵ MS 45
MT2 MS 45
MT3 WPM 45
MT4 B5
(Gamborg)
45
MT5 N6 (Chu) 45
Ghi chú: MS (Murashige and Skoog medium); WPM (Woody Plant Medium); B5 (Gamborg Medium); N6 (Chu medium)
2.2.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro
Khi đã tạo được mẫu sạch in vitro, tiến hành cắt chồi của cây mầm in vitro cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi (môi trường dinh dưỡng tốt nhất ở thí nghiệm 2 có bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau). Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng sử dụng BAP ở nồng độ từ 0,1 – 5 mg/l có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng bật chồi của mẫu cấy. Đối với cây Chùm Ngây, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến sự tạo thành chồi mới ở dải nồng độ từ 0,2 - 2,0 mg/l. Thí nghiệm được tiến hành với 7 công thức thí nghiệm, mỗi công thức được tiến hành trên môi trường dinh dưỡng cơ bản đã xác định được ở thí nghiệm 2, bổ sung 8 g/l agar + 30 g/l sucrose và chất điều hòa sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau. Thí nghiệm được bố trí như ở bảng 2.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro
CTTN
BAP (mg/l)
Tổng số mẫu cấy
(mẫu)
Số mẫu tái sinh
chồi (mẫu)
Tỉ lệ mẫu tái sinh chồi (%)
Số chồi TB/mẫu
(chồi)
Chiều cao TB chồi (cm)
CT0 0,0 45
CT1 0,2 45
CT2 0,4 45
CT3 0,6 45
CT4 0,8 45
CT5 1,0 45
CT6 2,0 45
2.2.2.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi chùm Ngây in vitro
Tham khảo một số tài liệu đã nghiên cứu về nhân giống Chùm Ngây, chúng tôi bổ sung thêm Kinetin vào môi trường nhân nhanh chồi. Công thức tốt nhất ở mục 2.2.2.2. được sử dụng để tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp giữa BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. Công thức môi trường MS + 8 g/l agar + 30 g/l sucrose + nồng độ BAP thích hợp nhất ở thí nghiệm 3 và kinetin được bổ sung ở các nồng độ khác nhau. Thí nghiệm được bố trí ở bảng 2.4.
Bảng 2.4: Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi chùm Ngây in vitro
CTMT BAP(mg/l) Kinetin (mg/l)
Tổng số mẫu
cấy (mẫu)
Số mẫu tái sinh
chồi (mẫu)
Tỉ lệ mẫu tái sinh
Số chồi TB/mẫu (chồi)
Chiều cao TB
chồi (cm)
CT7 0,20 40
CT8 0,40 40
CT9 0,60 40
CT10 0,80 40
CT11 1,00 40
2.2.2.5. 5: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ của chồi Chùm Ngây in vitro
Footer Page 36 of 126.