CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.3 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
3.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein thô
Protein thô được coi là giá trị N tổng số nhân với hệ số protein (hàm lượng N có trong protein). Với hầu hết các loại thức ăn, hệ số protein là 6,25 (16% N) thích hợp cho tất cả các loại thức ăn xanh. Riêng hạt lúa mì thì hệ số là 5,70 và sữa bò là 6,45. Vì vậy xác định hàm lượng protein thô là xác định N tổng số. Có nhiều phương pháp xác định N trong thức ăn, trong đó phương pháp Kjeldahl là phổ biến nhất.
Nguyên lý
Phương pháp Kjeldahl là phương pháp tiêu chuẩn để xác định hàm lượng nitrogen được phát triển từ thế kỷ XVIII. Phương pháp gồm ba bước:
Mẫu được vô cơ hóa bằng axít sulfuric đun nóng với sự có mặt của chất xúc tác, Nitrogen trong protein bị phân giải thành NH3.
NH3 lập tức biến thành (NH4)2SO4
Tác dụng với bazơ mạnh, NH3 được giải phóng khỏi dung dịch axít. Căn cứ vào lượng axít đã tiêu hao để trung hòa NH3, ta sẽ tính được lượng NH3, từ đó tính được lượng Nitrogen tổng số và suy ra lượng protein thô.
Phản ứng xảy ra như sau:
Thí dụ: Với Glycin ( NH2-CH2-COOH):
NH2-CH2-COOH + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3
2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4
(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O NH3 + H3BO3 NH4H2BO3
NH4H2BO3 + H2SO4 H3BO3 + NH4HSO4 Protein thô = N tổng số*6,25
Có thể vô cơ hóa bằng nhiều loại chất xúc tác khác nhau, với sự hỗ trợ của một số chất như: KMnO4, HClO4, hoặc H2O2. Nếu sử dụng H2O2 để gia tăng vận tốc thì phản ứng xảy ra như sau:
Công phá bằng H2SO4 đậm đặc có Selenium hòa tan và H2O2 làm chất xúc tác:
Cơ chế phản ứng oxi hóa như sau:
Ở nhiệt độ sôi 3380C H2SO4 tự phân hủy:
2H2SO4 2SO2 + 2H2O +[O]
H2O2 H2O +[O]
[O] được sinh ra khi phân hủy H2SO4 và H2O2 sẽ oxi hóa các cacbon của chất hữu cơ tạo thành CO2 và H2O đồng thời phóng thích NH3. NH3 kết hợp với H2SO4 tự do theo sơ đồ:
R-CH-COOH + n[O] n CO2 + n NH3 NH2
2NH3 +H2SO4 (NH4)2SO4
Vai trò của Selenium trong quá trình công phá mẫu là nâng cao nhiệt độ sôi của H2SO4, tăng cường quá trình thủy giải, phân hủy và oxi hóa các hợp chất hữu cơ.
Sau khi oxi hóa dễ dàng bằng H2SO4 sôi, Se sẽ biến thành tác nhân cho [O]
theo sơ đồ:
2H2SO4 + Se SO2 + H2SeO3 + H2O H2SeO3 SeO2 + H2O
Luận văn tốt nghiệp – Cử nhân Hóa K32
SeO2 Se + 2[O]
Selenium được giải phóng lần nữa lại tác động tương hỗ với H2SO4 và cứ thế quá trình được lặp lại. Thời gian công phá từ 45 phút đến 2 giờ. Lượng H2SO4 dùng từ 5 – 10 ml cho 0,2 g mẫu.
Qui trình phân tích Cân mẫu
Cân khoảng 0,1 g mẫu cho vào ống nghiệm, chuyển vào bình Kjeldahl 50 ml hoặc tam giác. Hiệu số giữa trọng lượng ống nghiệm có chứa mẫu và ống nghiệm rỗng là trọng lượng của mẫu (W). Cho vào một ít hỗn hợp chất xúc tác. Cho 5 – 7 ml H2SO4 đậm đặc, nếu mẫu chứa nhiều béo thêm 1ml cồn tuyệt đối để tránh hiện tượng sôi trào.
Giai đoạn 1: Công phá
Đặt bình Kjeldahl hoặc bình tam giác vào bếp điện hoặc lò công phá có bộ điều nhiệt. Khi đun thấy khói trắng bay lên, mẫu chuyển sang màu đen và sôi đều thì tăng nhiệt độ đến sôi mẫu. Đun đến khi mẫu trắng ra (45 phút đến 2 giờ tùy mẫu). Việc công phá tiến hành trong tủ hút khí độc.
Giai đoạn 2: Chưng cất
a. Hút 10 ml axít boric 2% ( có thuốc thử Methylred + Bromocresol green) vào bình tam giác 250 ml. Đặt bình nhận này sao cho đầu mút của ống ngưng ngập trong axít boric.
b. Chuyển mẫu từ bình công phá vào ống chưng cất (ống kjeldahl). Rửa ống công phá vài lần bằng nước cất cho vào ống chưng cất.
c. Cho từ từ đến 20 ml NaOH 33% vào ống chưng cất nhận mẫu chưng cất.
d. Thời gian chưng cất khoảng 5 – 10 phút.
e. Hạ bình tam giác để hứng tiếp bằng cách dùng nước cất rửa sạch ống.
f. Lấy bình tam giác ra. Chờ nước ở trong ống khí vừa xuống hết, lấy bình chưng cất chứa mẫu ra.
g. Dùng H2SO4 0,1 N để chuẩn độ nếu sử dụng axít boric làm dung dịch nhận, chuẩn độ đến khi màu xanh vừa chuyển sang màu hồng thì dừng.
. Tính kết quả
Lượng Nitơ tổng số được tính theo công thức:
( ) ( )
W N N V
N V − =
= * *0.014*100
%
'
tổng số
V: Thể tích H2SO4 dùng cho định phân mẫu (ml)
V’: Thể tích H2SO4 dùng cho định phân thí nghiệm trắng (ml) N: Độ nguyên chuẩn của dung dịch H2SO4 dùng trong định phân (N) W: Trọng lượng mẫu (g)
0,014: Hệ số tính ra N
Hàm lượng protein thô được tính như sau:
CP% = N%*6,25