CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
* Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Trích ly bằng hệ thống trích ly hỗ trợ vi sóng
Dung môi chiết: Methanol 100%
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 100/1
Thời gian ngâm: 30 phút
Mức công suất: 400W
Thời gian bức xạ: 10s/phút
Thời gian trích ly: 20 phút Rễ cây An xoa
Xử lý
Sấy khô bằng các phương pháp: sấy vi sóng, phơi
nắng, sấy thăng hoa
Nghiền nhỏ
Trích ly
Thu dịch chiết
Bảo quản
Phân tích hoạt chất sinh học và khả năng chống
ôxy hóa
27
* Thuyết minh sơ đồ:
Rễ cây An xoa: được thu hoạch tại thôn Hòn Nghê, xã Vĩnh Ngọc, TP. Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Rễ cây An xoa sau khi thu hoạch được giữ trong túi đá lạnh trong quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang. Quá trình vận chuyển rễ cây An xoa về phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt, để giảm tối thiểu quá trình ôxy hóa các hoạt chất trong rễ cây An xoa.
Xử lý: Tại phòng thí nghiệm, rễ cây An xoa được ngâm rửa bằng nước cất để loại bỏ cát, đất, để ráo nước, sau đó dùng con dao sắc cắt thành các khúc dài 1,5 - 2 cm. Sau đó các lát cắt rễ cây An xoa này được đóng gói vào 21 túi zip, mỗi túi 30g mẫu và đem bảo quản ở -18oC để phục vụ cho nghiên cứu.
Sấy khô, nghiền nhỏ: Mỗi túi zip chứa rễ cây An xoa được rã đông và sử dụng cho một phương pháp sấy. Mẫu rễ cây An xoa được sấy khô bằng các phương pháp sấy:
phơi nắng, sấy vi sóng: MW270, MW450, MW720, MW900, sấy thăng hoa cho đến khi độ ẩm còn lại dưới 10%; sản phẩm sau sấy được nghiền nhỏ thành dạng bột có kích thước < 1,4 mm bằng máy nghiền mẫu khô và sau đó tiến hành bao gói trong túi zip và bảo quản ở nhiệt độ -18oC để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo.
Trích ly: Tiến hành trích ly rễ cây An xoa bằng hệ thống trích ly hỗ trợ vi sóng tại phòng thí nghiệm, với các điều kiện trích ly như sau:
Phương pháp trích ly: Trích ly hỗ trợ vi sóng
Loại dung môi: Methanol 100%
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 100/1
Công suất vi sóng: 400W
Thời gian bức xạ: 10s/phút
Thời gian trích ly: 20 phút
Thu dịch chiết: Sau khi trích ly xong, dịch chiết thu được chứa trong ống nhựa có thể tích 50 ml. Sau đó thêm methanol 100% vào dịch chiết, định lượng đến vạch 50 ml để dễ tính toán về sau.
Bảo quản: Dịch chiết rễ cây An xoa được bảo quản ở nhiệt độ -18oC để sử dụng cho các phân tích tiếp theo.
Đánh giá các chất có hoạt tính sinh học và khả năng chống ôxy hóa: Dịch chiết rễ cây An xoa được dùng để xác định hàm lượng các hoạt chất sinh học như: Hàm lượng
28
phenolics tổng số (TPC), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC), hàm lượng saponins, và xác định khả năng khử gốc tự do DPPH.
2.2.2. Bố trí thí nghiệm chuẩn bị mẫu khô
* Sơ đồ bố trí thí nghiệm chuẩn bị mẫu khô
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chuẩn bị mẫu khô Rễ cây an xoa được
bảo quản -18oC
Rã đông
Sấy khô bằng các phương pháp sấy
khác nhau
Phơi nắng
Cân
Nghiền
Bao gói
Bảo quản
Sấy vi sóng Sấy thăng hoa
29
* Giải thích sơ đồ:
Rễ cây An xoa được bảo quản ở -18oC: Mẫu rễ cây An xoa đã được cắt khúc trước đó được chứa trong những túi zip và được bảo quản ở -18oC.
Rã đông: Mẫu chứa trong túi zip được rã đông hoàn toàn ở nhiệt độ phòng.
Sấy khô mẫu bằng các phương pháp sấy khác nhau: Sau khi rã đông, tiến hành sấy khô mẫu đến khối lượng không đổi sử dụng 3 phương pháp sấy khác nhau. Trong đó, 30g mẫu rễ cây An xoa tươi được sử dụng cho mỗi điều kiện sấy:
Sấy vi sóng: Mẫu tươi được sấy khô trong lò sấy vi sóng (Model: EMS3067X) ở các mức công suất 30% tức 270W (MW270), 50% tức 450W (MW450), 80% tức 720W (MW720), 100% tức 900W (MW900).
Phơi nắng: Mẫu tươi được phơi khô dưới ánh nắng mặt trời ở nhiệt độ t = 30,92
± 1,76 oC và độ ẩm 𝜑 = 58,84 ± 5,71%.
Sấy thăng hoa: Mẫu tươi được cấp đông ở -80oC trong 24h, sau đó được đưa vào máy sấy thăng hoa ở điều kiện sau:
+ Nhiệt độ set trong buồng sấy: -39oC + Độ chân không: 0,004 mBar
Cân: Sau khi sấy khô tiến hành cân lại mẫu khô. Sấy khô mẫu rễ cây An xoa đến khối lượng không đổi.
Nghiền nhỏ: Sau khi sấy rễ cây An xoa khô được nghiền nhỏ thành dạng bột có kích thước < 1,4 mm bằng máy nghiền mẫu khô.
Bao gói, bảo quản: Sau khi nghiền thành bột mịn, tiến hành bao gói trong túi zip và bảo quản ở nhiệt độ -18oC để chuẩn bị cho các phân tích sau đó.
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định các chỉ tiêu hóa lý đánh giá chất lượng rễ cây An xoa khô và hiệu quả phương pháp sấy
2.2.3.1. Độ ẩm dư
Độ ẩm của mẫu được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi
Nguyên tắc: Dùng không khí nóng làm bay hơi hết nước trong nguyên liệu, cân khối lượng mẫu trước và sau khi sấy. Khối lượng mẫu mất đi khi sấy khô tuyệt đối là lượng nước có trong mẫu. Từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu.
Tiến hành: Sấy cốc trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi, dùng cân phân tích xác định khối lượng cốc mo (g). Cho khoảng 1g bột rễ cây An xoa vào cốc
30
sấy, đem đi cân trên cân phân tích, ghi nhận khối lượng, khi đó tổng khối lượng cốc cân và mẫu là m1 (g).
Đặt cốc vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC, sấy qua đêm. Sau đó lấy cốc sấy cho vào bình hút ẩm khoảng 30 phút, cân cốc mẫu đã sấy. Khi đó khối lượng cốc và mẫu sau sấy là m2 (g).
Kết quả tính độ ẩm (W) W = 𝑚1−𝑚2
𝑚1−𝑚𝑜∗ 100 (%) (2.1) Trong đó:
mo: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi m1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy
m2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi 2.2.3.2. Hoạt độ nước
Hoạt độ nước của sản phẩm được xác định bằng máy đo hoạt độ nước HYGROLAB C1 của Rotronic ở nhiệt độ 30oC.
2.2.3.3. Năng suất sấy
Năng suất sấy được xác định theo công thức sau:
DY = 𝐷𝑆
𝐹𝑆∗ 100 (%) (2.2) Trong đó:
DY là năng suất sấy
DS (g) là khối lượng của mẫu khô sau khi sấy FS (g) là khối lượng của mẫu tươi trước khi sấy 2.2.3.4. Thời gian sấy và tiêu hao năng lượng
Thời gian sấy được xác định bằng đồng hồ bấm giờ
Tiêu hao năng lượng: Tiêu hao năng lượng cho các phương pháp sấy khác nhau được ước tính bằng cách sử dụng phương trình sau:
Wi = Pi*Ti (2.3) Trong đó:
Wi là năng lượng điện tiêu thụ của phương pháp sấy (i) (kWh) Pi là điện năng cung cấp trong phương pháp sấy i (kW)
Ti là thời gian sấy của phương pháp sấy (i) (h)
31 2.2.4. Bố trí thí nghiệm trích ly mẫu khô
Rễ cây An xoa khô được trích ly bằng phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng, theo phương pháp đã được mô tả trước đây [46].
* Sơ đồ bố trí thí nghiệm trích ly mẫu khô
0,5 g bột rễ cây An xoa khô
Ngâm 30 phút
Thêm 50 ml methanol 100%
Trích ly bằng hệ thốngtrích ly hỗ trợ vi sóng
Thu dịch chiết Làm lạnh - Lọc
Bảo quản
Công suất vi sóng: 400W
Thời gian bức xạ: 10 s/phút
Thời gian trích ly: 20 phút
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm trích ly mẫu khô
32
* Thuyết minh sơ đồ:
Cân 0,5 g mẫu khô, thêm vào 50 ml methanol 100%, ngâm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó, trích ly bằng hệ thống trích ly hỗ trợ vi sóng với các thông số: Công suất vi sóng 400W, thời gian bức xạ 10 s/phút, thời gian trích ly là 20 phút. Sau khi trích ly, dịch chiết được làm lạnh nhanh bằng nước đá đến nhiệt độ phòng, sau đó lọc qua giấy lọc Whatman no 1. Sau khi lọc xong, dịch chiết được chứa trong ống nhựa có thể tích là 50 ml, thêm methanol vào để định lượng về cùng một thể tích 50 ml để dễ tính toán về sau. Dịch chiết sau khi trích ly được bảo quản ở -18oC để phục vụ cho việc xác định năng suất chiết, các hoạt chất sinh học và khả năng chống ôxy hóa.
2.2.5. Bố trí thí nghiệm xác định năng suất chiết và hàm lượng các hoạt chất sinh học của rễ cây An xoa khô
2.2.5.1. Xác định năng suất chiết
Năng suất chiết (EY) là khối lượng của dịch chiết khô trên 100 g mẫu khô.
Năng suất chiết được xác định theo phương pháp được mô tả bởi Nguyễn và cộng sự [46]. Trong đó, 5 ml dịch chiết được sấy khô trong lò sấy chân không ở 80oC để qua đêm đến khối lượng không đổi. Năng suất chiết được xác định theo công thức:
EY = 𝐷𝐸
𝐷𝑆∗ 100 (g) (2.4) Trong đó:
EY: Năng suất chiết
DE (g): Khối lượng của dịch chiết khô sau khi sấy
DS (g): Khối lượng tuyệt đối của mẫu khô trước khi chiết 2.2.5.2. Phân tích hàm lượng phenolics tổng số (TPC)
TPC của chiết xuất rễ cây An xoa được xác định theo phương pháp được mô tả trước đây [55]. Trong đó, 0,5 ml dịch chiết được trộn với 2,5 ml chất thử Folin-ciocalteu 10% (v/v) trong nước cất, để ổn định trong 6 phút. Thêm 2 ml dung dịch Na2CO3 7,5%
vào. Hỗn hợp được ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 1 h. Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở 765 nm sử dụng máy quang phổ kế UV-Vis. Acid gallic được sử dụng làm chất chuẩn. Hàm lượng TPC được biểu diễn tương đương với mg acid gallic/g chất khô (mg GAE/g mẫu khô).
33
2.2.5.3. Phân tích hàm lượng flavonoids tổng số (TFC)
TFC của chiết xuất rễ cây An xoa được xác định theo phương pháp được mô tả trước đây [55]. Cụ thể, 0,5 ml dịch chiết được trộn với 2 ml nước cất và 0,15 ml dung dịch NaNO2 5% (w/v). Hỗn hợp được ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 6 phút.
Sau đó, thêm 0,15 ml AlCl3 10% (w/v) và ủ hỗn hợp trong 6 phút nữa ở nhiệt độ phòng.
Cuối cùng, thêm vào 2 ml dung dịch NaOH 4% (w/v) và 0,7 ml nước cất và ủ trong 15 phút nữa. Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở bước sóng 510 nm sử dụng máy quang phổ kế UV-Vis. Catechol được sử dụng làm chất chuẩn. Hàm lượng TFC được biểu diễn tương đương với mg catechol/g chất khô (mg CE/g mẫu khô).
2.2.5.4. Phân tích hàm lượng saponins
Hàm lượng saponins của dịch chiết rễ cây An xoa được xác định theo phương pháp được mô tả trước đây [55]. Cụ thể, 0,25 ml dịch chiết được trộn với 0,25 ml dung dịch vanillin 8% (w/v). Sau đó, thêm 2,5 ml dung dịch H2SO4 72% (v/v) vào hỗn hợp. Hỗn hợp được ủ ở 70oC trong 15 phút và nhanh chóng làm lạnh bằng nước đá đến nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở bước sóng 560 nm sử dụng máy quang phổ kế UV-Vis. Escin được sử dụng làm chất chuẩn. Hàm lượng saponins được biểu diễn tương đương với mg escin/g chất khô (mg EE/g mẫu khô).
2.2.6. Bố trí thí nghiệm xác định khả năng chống ôxy-hóa của rễ cây An xoa khô thông qua khả năng quét gốc tự do DPPH (DRSC)
DRSC của dịch chiết rễ cây An xoa được xác định theo phương pháp được mô tả trước đây [46]. Một dung dịch DPPH gốc được chuẩn bị bằng cách hòa tan 24 mg DPPH vào 100 ml methanol và được lưu trữ ở -18oC. Trước khi sử dụng, một dung dịch phản ứng được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1 ml dung dịch gốc với 4,5 ml methanol để dung dịch có độ hấp thụ là 1,1 ± 0,02 ở 515 nm. Sau đó, 0,15 ml dịch chiết được trộn với 2,85 ml dung dịch phản ứng và được ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 3 h. Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở bước sóng 515 nm sử dụng máy quang phổ kế UV-Vis. DPPH được sử dụng làm chất chuẩn. Kết quả được biểu diễn theo mg của DPPH/g chất khô (mg DPPH/g mẫu khô).