ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Lá cây Khôi đốm được thu hái vào tháng 15/01/2018 tại Thị trấn Cổ Lễ, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định, phơi sấy, bảo quản trong túi nilon kín.

Mẫu cây này được ThS.Nguyễn Quỳnh Nga, Viện Dược liệu giám định tên khoa học là: Sanchezia nobilis Hook.f. họ Acanthaceae (họ Ô rô). Mẫu cây được lưu tại: Phòng tiêu bản, Khoa Tài Nguyên Cây Thuốc, Viện Dược liệu (số hiệu tiêu bản: DL-150118).

Hình 2.1: Hình ảnh cây Khôi đốm

22 2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.2.1. Hóa chất và dung môi

Chiết xuất và phân lập sử dụng các dung môi: (EtOH 80%, n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), dichloromethan (DCM), aceton (Ac)... Tất cả các dung môi này đều đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết.

Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel pha thường cỡ hạt 0,063- 0,200 mm (Merck), (0,040 - 0,063 mm, Merck). Bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)...

2.1.2.2. Trang thiết bị

Sắc ký cột: sắc ký các loại cột thủy tinh có kích cỡ khác nhau.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ khối ESI-MS: đo trên máy AGILENT 1260 Series LC-MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ), Khoa Y Dược, ĐHQGHN.

Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Khoa Y Dược, ĐHQGHN.

Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 BioCote, Khoa Y Dược, ĐHQGHN.

Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: ống nghiệm, bình nón, bình gạn, cốc có mỏ, pipet…

Các thiết bị khác: Tủ sấy, tủ hút, cân phân tích, máy ảnh kỹ thuật số…

23 2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất

Mẫu lá cây Khôi đốm sau khi thu hái đã rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín. Mẫu dược liệu được ngâm chiết bằng dung môi ethanol 80% (3 lần, mỗi lần 8L), ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Lọc các dịch chiết ethanol thu được qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao chiết tổng ethanol.

Phân tán cao chiết ethanol này trong nước cất và chiết phân bố bằng n- hexan và ethyl acetat (3 lần). Thu được các phân đoạn n- hexan, ethyl acetat và nước. Các phân đoạn này được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng.

Sử dụng phương pháp sắc ký cột để phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat. Các phân đoạn trong quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng điều chế.

Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo, lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Silicagel pha thường cỡ hạt là 0,063-0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040-0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau.

Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck), độ dày 0,2 mm và RP-18F254s, độ dày 0,25 mm (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó được phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và đốt nóng trên bếp điện từ.

Sắc ký lớp mỏng điều chế (pTLC): được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60G F254, độ dày 1,0 mm (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365

nm hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, đốt nóng trên bếp điện từ, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất bằng dung môi thích hợp.

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,

13C-NMR, DEPT) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố

2.2.2.1. Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử. Phổ khối lượng không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỷ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z). Khi đó để xác định khối lượng phân tử (M) cần phải biết số điện tích của ion.

Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử, cùng các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết. So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác[3].

2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I) lẻ (1H, 13C...) được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng:

thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng

lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường). Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó. Có 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này. Cách thứ nhất là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét. Cách thứ hai là ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân. Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform - NMR, FT - NMR) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay.

Như đã trình bày ở trên, tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy. Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao.

Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz... là theo tần số dùng để kích thích các proton[3].

Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau. Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1H hay

13C) như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY).

Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học củaproton trong phân tử. Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ dịch chuyển hóa học khác nhau. Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hóa học thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh. Đỉnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba… tới đỉnh thành phần. Diện tích mỗi đỉnh tỷ lệ với số lượng proton của đỉnh. Dựa vào diện tích của đỉnh có thể biết số proton của đỉnh đó.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon. Carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm. Carbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm. Carbon lai hóa sp2 chuyển dịch trong khoảng 100-150 ppm, nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể dịch chuyển tới 240 ppm. Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon (hơn 1 carbon nếu cũng có chung môi trường hóa học) của phân tử.

Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử.

Kỹ thuật hiện thường sử dụng là DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer).

Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó, giữa các proton của carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và các carbon kế cận (thường sử dụng hiện nay là kỹ thuật HSQC) hay xa hơn (long-range HETCOR, thường dùng hiện nay là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY)[3].

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Về phương pháp chiết xuất phân lập