Về phương pháp chiết xuất phân lập

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.2.1. Về phương pháp chiết xuất phân lập

Phương pháp chiết xuất bằng EtOH và phân lập các chất bằng sắc ký cột được tham khảo từ các nghiên cứu trước đó. Đề tài đã chiết xuất cao toàn phần từ lá cây Khôi đốm bằng phương pháp ngâm tại nhiệt độ phòng với dung môi cồn 80%. Phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, chi phí thấp thu được khối lượng cắn toàn phần đạt 6% so với lượng dược liệu ban đầu. Cắn toàn phần sau đó được chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, ethyl acetat và chạy qua cột sắc ký Diaion, thu được lần lượt các cắn phân đoạn với khối lượng đạt lần lượt 0,368% (phân đoạn n-hexan); 1,152% (phân đoạn ethyl acetat); 1,064% (phân đoạn nước) so với nguyên liệu khô ban đầu.

Kết quả phân lập được 2 thành phần từ phần lá của cây lá Khôi đốm thu tại tỉnh Nam Định. Cấu trúc các hợp chất này được xác định thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối, phổ cộng hưởng hạt nhân và so sánh với các dữ liệu công bố của các hợp chất liên quan. Hai hợp chất được xác định là Rutin (X6), Epicatechin (X9).

35 3.2.2. Về hai hợp chất đã phân lập được

3.2.2.1. Hợp chất X6

Hợp chất X6 được xác định là Rutin (quercetin-3-O-[α-L- rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside). Chất này cũng được phân lập từ Salvia leucantha, Fagopyrum esculentum, Carpobrotus edulis,…[16, 25, 32]. Rutin cũng được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm thông thường như:

olive đen, mận, cà chua bi, nho khô, mơ, trà xanh, táo,…[39].

Trong nghiên cứu “Tinh chế và xác định các thành phần kháng khuẩn hoạt động trong Carpobrotus edulis L.” của Elmarie van der Watt và Johan C Pretorius, ban đầu chiết xuất methanolic thô của cây được thử nghiệm và cho kết quả có tác dụng chống vi khuẩn mạnh. Sau đó, dịch chiết thô được phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lỏng-lỏng, tannin được loại bỏ bằng phương pháp sắc ký cột LH20 và phân đoạn có hoạt tính sinh học với đặc tính kháng khuẩn được phân lập bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Năm hợp chất có hoạt tính sinh học, có hoạt tính đơn lẻ hoặc kết hợp đối với đặc tính kháng khuẩn C. edulis, được tinh chế từ phân đoạn ethyl acetate hoạt động. Các hợp chất này ban đầu được xác định là flavanoids bằng phương pháp standard fingerprinting và cuối cùng được xác định là rutin, neohesperidin, hyperoside, cactichin và axit ferulic [16].

Rutin có hoạt tính chữa lành vết thương đáng kể và cũng là loại thuốc được tìm thấy có hoạt tính kháng khuẩn cho cả vi khuẩn gram dương và gram âm[16, 25].

Trong nghiên cứu “Hoạt động kháng khuẩn và làm lành vết thương của Quercetin-3-O--L-Rhamnopyranosyl-(1-6) -β-D-Glucopyranoside phân lập từ Salvia leucantha” của Manivannan Rajamanickam và cộng sự, Quercetin- 3-O--L-Rhamnopyranosyl-(1-6) -β-D-Glucopyranoside, sau khi được phân lập từ Salvia leucantha, đã được thử tác dụng kháng khuẩn trên các vi khuẩn

gram dương Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis, Sarcina lutea và các vi khuẩn gram âm Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans và so sánh với một số kháng sinh thương mại. Kết quả cho thấy: tại vùng ức chế tối đa, quercetin glycosides chống lại tất cả các vi sinh vật thử nghiệm và quercetin glycosides ức chế Staphylococcus aureus và Escherichia coli tốt hơn so với các loại vi sinh vật còn lại[25].

3.2.2.2. Hợp chất X9

Trước khi được phân lập từ Sanchezia nobilis, hợp chất X9 (Epicatechin) cũng đã từng được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như: lá cây Amaranthus cruentus L. (Amaranthaceae), trà hoa vàng Camellia chrysantha, Azadirachta indica, Bulnesia sarmienti, lá loquat Eriobotrya japonica, ca cao,...[13, 15, 19, 36, 37]. Cùng với đó, epicatechin cũng được nghiên cứu và phát hiện ra nhiều tác dụng dược lý khác nhau như: chống oxi hóa, kháng khuẩn, giúp cải thiện chức năng mạch máu, chống ung thư, giúp làm giảm hội chứng tắc nghẽn xoang gan,…[13, 15, 20, 22, 24, 38].

Cụ thể, tác dụng chống oxy hóa của (-) - epicatechin, (-) - epicatechin gallate và quercetin đã được kiểm tra bằng cách đo sự ức chế peroxid hóa lipid trong liposome unilamellar lớn bao gồm phosphatidyicholine trong lòng đỏ trứng. Từ kết quả quan sát được, các nhà khoa học kết luận rằng catechin và quercetin đóng vai trò là chất chống oxy hóa mạnh mẽ chống lại quá trình peroxy hóa lipid khi hai loại phospholipid tiếp xúc với các gốc oxy tự do trong nước[22].

Năm 2011, nghiên cứu “Chế độ ăn uống Epicatechin thúc đẩy sự sống sót của chuột bị tiểu đường béo phì và Drosophila melanogaster” của Hongwei Si và các cộng sự đã chỉ ra được nhiều tác dụng của Epicatechin:

- Bổ sung epicatechin vào chế độ ăn uống thúc đẩy sự sống sót của chuột mắc bệnh tiểu đường.

- Epicatechin cải thiện sự thay đổi bệnh lý ở động mạch chủ và gan.

- Epicatechin cải thiện dấu ấn sinh học liên quan đến tuổi ở chuột mắc bệnh tiểu đường.

- Epicatechin cải thiện chức năng cơ xương ở chuột mắc bệnh tiểu đường.

- Epicatechin cải thiện hoạt động AMPKα ở gan và cơ xương của chuột mắc bệnh tiểu đường.

- Epicatechin làm tăng tuổi thọ của Drosophila.

[20]

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận

Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận đã thu được một số kết quả như sau :

+ Chiết xuất, phân lập: Đã sử dụng phương pháp chiết ngâm với dung môi EtOH 80% và bằng phương pháp sắc ký cột để chiết xuất phân lập được 2 hợp chất từ lá của cây Khôi đốm

+ Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được: Thông qua kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ tử ngoại- khả kiến, phổ khối, và phổ cộng hưởng hạt nhân, đã xác định được cấu trúc của 2 hợp chất là: Rutin (quercetin-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside(X6), và epicatechin(X9). Đây là lần đầu tiên 2 hợp chất này được phân lập từ dịch chiết phân đoạn ethylacetat của lá cây Khôi đốm.

Kiến nghị

+ Tiếp tục triển khai phân lập các hợp chất khác từ loài Sanchezia nobilis Hook.f.

+ Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết phân đoạn ethylacetat và các hợp chất phân lập được từ cao phân đoạn ethylacetat.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1. Nguyễn Tiến Bân (2005), Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Tập III, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

2. Bộ Môn Dược Liệu Đại Học Dược Hà Nội (2009), Thực tập dược liệu.

3. Bộ Y Tế (2011), Dược liệu học I, Nhà xuất bản Y học.

4. Phan Văn Chiêu (2011), Đông nam dược nghiệm phương, Nhà xuất bản Thuận Hóa.

5. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, Quyển 3, Nhà xuất bản Trẻ.

6. Nguyễn Thị Mai (2017), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học lá cây Xăng sê, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

7. Vũ Thị Mây (2018), Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn dịch chiết ethylacetat của lá cây Khôi đốm (Sanchezia nobilis Hook.f), Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Tiếng Anh

8. Abu Shuaib Rafshanjani, Shumaia Parvin, Abdul Kader, Monika Rani Saha, and Most.Afia Akhtar (2014), "In vitro antibacterial, antifungal and insecticidal activities of ethanolic extract and its fractionates of Sanchezia speciosa Hook. f", International Research Journal of Pharmacy, 5(9), 717-720.

9. Ahmed E. Abd-Ellah, Khaled M. Mohamed, Enaam Y. Backheet, and Mahmoud H. Mohamed (2006), "Macro-and micromorphology of Sanchezia nobilis Hook. cultivated in Egypt: leaf, stem and flower", Bulletin of Pharmaceutical Sciences, 29(2), 300-327.

10. Ahmed E. Abd Ellah, Khaled M. Mohamed, Enaam Y. Backheet, and Mahmoud H. Mohamed (2013), "Matsutake alcohol glycosides from Sanchezia nobilis", Chemistry of Natural Compounds, 48(6), 930-933.

11. Ahmed E. Abd Ellah, Khaled M. Mohamed, Enaam Y. Backheet, and Mahmoud H. Mohamed (2014), "Cinnamyl Alcohol, Benzyl Alcohol, and Flavonoid Glycosides from Sanchezia nobilis", Chemistry of Natural Compounds, 50(5), 715-717.

12. Armen Leonovich Takhtadzhi͡An (1997), Diversity and classification of flowering plants, Columbia University Press, New York, USA.

13. Young-Il Jeong Bae, Chang-Ho Shim, Ki-Hwan, (2005),

"Antioxidative and Antimicrobial Activity of Epicatechin Isolated from Leaves of Loquat (Eriobotrya japonica)", Preventive Nutrition and Food Science, 10(2), 118-121.

14. Cristiane Pereira, Cleber Bomfim Barreto Júnior, Ricardo Machado Kuster, Naomi Kato Simas, Cassia Mônica Sakuragui, Andrea Porzel, and Ludger Wessjohann (2012), "Flavonoids and a neolignan glucoside from Guarea macrophylla (Meliaceae)", Química Nova, 35(6), 1123- 1126.

15. Daeik Kim, Mohammad Lalmoddin Mollah, and Kilsoo Kim (2012),

"Induction of Apoptosis of SW480 Human Colon Cancer Cells by (−)- Epicatechin Isolated from Bulnesia sarmienti", Anticancer Research, 32 (12 ), 5353-5361.

16. Elmarie Van Der Watt and Johan C Pretorius (2001), "Purification and identification of active antibacterial components in Carpobrotusedulis L.", Journal of Ethnopharmacology, 76 (1), 87-91.

17. Emery C. Leonard and Lyman B. Smith (1964), "Sanchezia and related American Acanthaceae", Rhodora, 66(768), 313-343.

18. Erin A. Tripp and Daniel M. Koenemann (2015), "Nomenclatural Synopsis of Sanchezia (Acanthaceae), Fifty Years Since Last Treated", Novon: A Journal for Botanical Nomenclature, 24(2), 213-221.

19. Francisco Cen-Pacheco, Araceli Ortiz-Celiseo, Alvaro Peniche- Cardeủa, Omar Bravo-Ruiz, Fernando C. Lúpez-Fentanes, Gerardo Valerio-Alfaro, and José J.Fernández (2019), "Studies on the bioactive flavonoids isolated from Azadirachta indica", Natural Product Research, Published online.

20. Hongwei Si, Zhuo Fu, Pon Velayutham Anandh Babu, Wei Zhen, Tanya Leroith, Mary Pat Meaney, Kevin A. Voelker, Zhenquan Jia, Robert W. Grange, and Dongmin Liu (2011), "Dietary Epicatechin Promotes Survival of Obese Diabetic Mice and Drosophila melanogaster ", The Journal of Nutrition, 141(6), 1095–1100.

21. Jin Hye-Young, Ahn Tai-Hyeon, Song Jeong Hwa, Lee Junseok, and Choi Ha Yong (2012), "Biological Control Against Aphids Using Natural Enemies in Tropical Plants Resources Research Center of Korea National Arboretum", Journal of the Korea Society of Environmental Restoration Technology, 15(1), 27-33.

22. Junji Terao, Mariusz Piskula, and Qing Yao (1994), "Protective Effect of Epicatechin, Epicatechin Gallate, and Quercetin on Lipid Peroxidation in Phospholipid Bilayers", Archives of Biochemistry and Biophysics, 308(1), 278-284.

23. Loi Vu Duc, Tung Bui Thanh, Ha Vu Hoang, and Tuyen Nguyen Manh (2016), "Phytochemical and anti-inflammatory effect from the leaf of Sanchezia speciosa Leonard growing in Vietnam", Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 8(7), 309-315.

24. M.E.Alaủún, S.M.Castle, G.Serra, A.Lộvốques, L.Poquet, L.Actis- Goretta, and J.P.E.Spencer (2019), "Acute study of dose-dependent

effects of (−)-epicatechin on vascular function in healthy male volunteers: A randomized controlled trial", Clinical Nutrition, Published online.

25. Manivannan Rajamanickam, Prabakaran Kalaivanan, and Ilayaraja Sivagnanam (2013), "Antibacterial and Wound Healing Activities of Quercetin-3-O-Α-L-Rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-Glucopyranoside Isolated from Salvia leucantha", International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 22(1), 264-268.

26. Ming Xin Ren, Xiao Hui, Deng Fang Ai, Guo Yan Yuan, and Hai Yan Song (2015), "Effect of quercetin on the proliferation of the human ovarian cancer cell line SKOV-3 in vitro", Experimental and therapeutic medicine, 10(2), 579-583.

27. Mohammadjavad Paydar, Yi Li Wong, Bushra Abdulkarim Moharam, Won Fen Wong, and Chung Yeng Looi (2013), "In vitro anti-oxidant and anti-cancer activity of methanolic extract from Sanchezia speciosa leaves", Pakistan Journal of Biological Sciences, 16(20), 1212-1215.

28. Monroe E. Wall, C. S. Penske, H. E:Kenney, J. J. Willaman, D. S.

Correll, B. G. Schubert, and H. S. Gentry (1954), "Steroidal sapogenins: XII. Survey of plants for steroidal sapogenins and other constituents", Joournal of the American Pharmaceutical Association, 43(8), 503-505.

29. Monroe E. Wall, C. S. Penske, H. E:Kenney, J. J. Willaman, D. S.

Correll, B. G. Schubert, and H. S. Gentry (1954), "Steroidal sapogenins: VII. Survey of plants for steroidal sapogenins and other constituents", Joournal of the American Pharmaceutical Association, 43(1), 1-7.

30. Monroe E. Wall, C. S. Penske, H. E:Kenney, J. J. Willaman, D. S.

Correll, B. G. Schubert, and H. S. Gentry (1957), "Steroidal sapogenins

XLIII. Survey of plants for steroidal sapogenins and other constituents", Joournal of the American Pharmaceutical Association, 46(11), 653-684.

31. Sciences W. A. O. And Sciences. W. A. O. (1922), Journal of the Washington Academy of Sciences.

32. Samo Kreft, Mark Knapp, and Ivan Kreft (1999), "Extraction of rutin from buckwheat (Fagopyrum esculentumMoench) seeds and determination by capillary electrophoresis", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(11), 46-52.

33. And Sciences. W. A. O. Sciences W. A. O (1926), Journal of the Washington Academy of Sciences.

34. Shumaia Parvin, Abu Shuaib Rafshanjani, Abdul Kader, and Tahmida Sharmin (2015), "Preliminary phytochemical screening and cytotoxic potentials from leaves of Sanchezia speciosa Hook. f", International Journal of Advances in Scientific Research, 1(3), 145-150.

35. Steenis. M. Van and Joop Van Lenteren (1995), Evaluation and application of parasitoids for biological control of Aphis gossypii in glasshouse cucumber crops, Agricultural University.

36. Touré Abdoulaye, Kablan Ahmont Landry Claude, Kabran Aka Faustin, Adiko N’dri Marcelline, Kablan Richmond Jean-Franỗois, Akoubet Ouayogodé Aminata, Konan Dibi Jacques, Gnaoré Dohouré Toussaint, Attioua Koffi Barthélémy, and Coulibaly Adama (2018),

"Isolation of (+)-catechin and (-)-epicatechin from the leaves of Amaranthus cruentus L. (Amaranthaceae)", International Journal of Chemical Studies, 6(2), 3697-3700.

37. Van Nguyen Thi Hong, Bach Pham Cao, Inh Cam Thi, Phuong Doan Lan, Thanh Le Tat, Toan Tran Quoc, and Long Pham Quoc (2019),

"Flavonoids isolated from the flowers of Camellia Chrysantha", Vietnam journal of science and technology, 57(3).

38. Zhenlin Huanga, Xiaoqi Jingab, Yuchen Shengb, Jiaqi Zhanga, Zhanxia Haoa, Zhengtao Wanga, and Lili Jia (2019), "(-)-Epicatechin attenuates hepatic sinusoidal obstruction syndrome by inhibiting liver oxidative and inflammatory injury", Redox Biology, 22.

Website

39. Foods in which the polyphenol Quercetin 3-O-rutinoside is found, accessed, from http://phenol-explorer.eu/contents/polyphenol/296.

40. Nguyễn Thúy Oanh (2019), Tìm hiểu về bệnh viêm loét dạ dày tá tràng, accessed, from https://www.vinmec.com/en/tin-tuc/thong-tin-suc- khoe/tim-hieu-ve-benh-viem-loet-da-day-ta-trang/.

41. Sanchezia, accessed, from http://www.stuartxchange.org/Sanchezia.

42. Web Site Bộ Y Tế (2017), Khoảng 70 phần trăm người Việt Nam nhiễm loại vi khuẩn có thể gây ung thư dạ dày, accessed, from http://moh.gov.vn/web/urlTitle=khoang-70-nguoi-viet-nam-nhiem- loai-vi-khuan-co-the-gay-ung-thu-da-day.

43. Xăng xê chữa đau dạ dày, accessed, from https://chuabenhtieuhoa.net/cay-xang-se-chua-dau-da-day-

n4266.html.

PHỤ LỤC Phiếu kết quả giám định mẫu

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU