Phương pháp sắc ký do nhà bác học người Nga Mikhail Tewett phát minh vào năm 1903. Ông đã dùng cột chứa oxit nhôm tách các pigment của lá cây thành các vùng màu riêng biệt.
Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.5.1. Đặc điểm chung của các phương pháp sắc ký
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí.
Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học. Sắc ký là phương pháp nhanh, dễ dàng và không ảnh hưởng đến protein, đây là phương pháp được đề nghị trong nghiên cứu định lượng protein hay các phân tử.
1.5.2. Phân loại các phương pháp sắc kí 1.5.2.1. Theo bản chất vật lý các pha
Trong phương pháp sắc kí, pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai nhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí.
1.5.2.2. Theo kỹ thuật và phương tiện sắc ký 1.5.2.2.1. Theo phương pháp giữ pha tĩnh
1. Sắc ký trên cột (column chromatography: CC)
Đây là phương pháp sắc kí đơn giản nhất, phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại. Tuy
nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được). Khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.
Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.
Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng. Tuỳ theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 – 1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 – 1/30.
Trong sắc kí cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silicagel pha thường và pha đảo. Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 àm, Fujisilisa Chemical Ltd.).
2. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography: TLC)
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc kí cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp.
Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silicagel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí, người ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng
đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
F254 (Merck 1,05715), RP18F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai
bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ cho đến khi hiện màu.
3. Sắc ký giấy (paper chromatography: PC)
Sắc ký giấy (SKG) là loại sắc ký dùng giấy làm giá mang pha tĩnh. Đây là một kỹ thuật hóa học phân tích được dùng để tách và xác định các thành phần trong cùng một hỗn hợp của các chất màu, đặc biệt là sắc tố.
Đây là một kỹ thuật hữu ích bởi vì nó thực hiện tương đối nhanh chóng và chỉ cần một lượng nhỏ vật liệu mẫu. Thông thường sắc ký giấy dùng để định tính sản phẩm hơn là định lượng chất.
1.5.2.2.2 Theo cách cho pha động chạy
1. Sắc ký khai triển (development chromatography): cho pha động kép các chất chạy và tách trên pha tĩnh (Sắc đồ nằm trên pha tĩnh).
2. Sắc ký rửa giải (elution chromatography): cho pha động chạy và kép các chất lần lượt ra ngoài pha tinh (ra khỏi cột, ra khỏi giây).
1.5.2.3. Theo hiện tượng sắc ký
1. Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography):pha tĩnh là một chất rắn có khả năng hấp phụ, đó là các phương pháp sắc ký lỏng – rắn và khí – rắn.
2. Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh là chất lỏng không hòa lẫn được với pha động, chất lỏng này được bao trên bề mặt của một chất rắn gọi là giá hay chất mang và phải là chất trơ, không tham gia vào sắc ký. Sắc ký phân bố bao gồm sắc ký lỏng – lỏng và sắc ký khí – lỏng.
3. Sự trao đổi ion (ion – exchange chromatography): pha tĩnh là chất nhựa trao đổi ion chớp nhất cao phân tử có mang những ion có khả năng trao đổi với các ion cùng dấu của dung dịch hỗ hợp sắc ký.
4. Sắc ký theo loại cỡ (size – exclusion chromatogrphy): còn gọi là sắc ký trên gel. Các phân tử cỡ lớn sẽ được loạt các phân tử nhỏ hơn sẽ được tách theo kích thước do các phân tử nhỏ di chuyển chậm hơn.