Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp sắc kí so sánh…
1.6.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300 - 3450 cm-1, của nhóm carbonyl C = O trong khoảng 1700 - 1750 cm1.
1.6.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:
- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV.
- Phổ ESI-MS (Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
- Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution mass spectroscopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
- Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí - khối phổ) cho các chất dễ bay hơi như tinh dầu hay LC-MS (sắc kí lỏng - khối phổ) cho các hợp chất khác. Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược).
1.6.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và carbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
1.6.3.1. Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
1.6.3.2. Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ carbon. Mỗi nguyên tử carbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau.
Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230ppm.
1.6.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer): Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại carbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các carbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH.
1.6.3.4. Phổ 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shif Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với carbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ với cường độ mạnh hơn.
Ngoài ra, người ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơnghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể.
Nhưng phạm vi sử dụng của phổ này hạn chế vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh, kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác được chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.
Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất bằng các phương pháp phổ: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1. Nguyên liệu