Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Điều tra, thu thập xác định thành phần loài sâu hại và thiên địch quan trọng trên cây hồi tại Lạng Sơn.
2.5.1.1. Điều tra, thu thập xác ịnh thành phần sâu hại cây hồi
Điều tra theo Quy chuẩn quốc gia QCVN 01-38:2010/ BNNPTNT về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2010) và theo phương pháp của (Nguyễn Thế Nhã và cs, 2001); Nguyễn Thế Nhã và Trần Văn Mão (2005).
Chọn i m: Các điểm điều tra là các huyện đại diện cho khu vực nghiên cứu, có diện tích cây hồi (cây thức ăn) nhiều nhất, sâu hại chính thường gây hại hoặc phát dịch thường xuyên.
Chọn 5 huyện điều tra, mỗi huyện chọn 3 xã, có diện tích trồng cây hồi nhiều nhất. Tại mỗi xã, chọn từ 3-5 điểm. Mỗi điểm điều tra chọn 3 lâm phần có diện tích từ 5-10 ha đại diện cho 3 cấp tuổi rừng tại địa bàn đó là: rừng non chƣa khép tán, rừng sào và rừng trung niên.
Mỗi lâm phần điều tra lập 6 ô tiêu chuẩn, mỗi ô có diện tích 1.000m2 (20 m x 50 m). Ô tiêu chuẩn đại diện cho các dạng địa hình khác nhau: chân đồi - sườn đồi - đỉnh đồi và đặt ở các hướng khác nhau. Trong ô tiêu chuẩn chọn 30 cây tiêu chuẩn theo phương pháp rút mẫu hệ thống.
Đối với cây tiêu chuẩn điều tra sâu hại theo các chỉ tiêu: Điều tra đánh giá mức độ sâu ăn lá, điều tra số lƣợng, chất lƣợng sâu ăn lá.
Đối với những lâm phần tái sinh gốc chặt hoặc trồng mới có chiều cao cây dưới 3,5m trong tầm với có các cành lá mang sâu thì chủ yếu dùng phương pháp điều tra quan sát trực tiếp bằng mắt thường để phát hiện và bắt tất cả các cá thể ở mỗi pha.
Đối với những lâm phần cây cao > 3,5m mà các cành lá mang sâu ở trên cao có thể phát hiện thấy sâu non tuổi lớn, nhộng hay trưởng thành bằng phương pháp
“nhìn ng ợc sáng” để quan sát. Sau đó trèo lên cây để chặt cành tiêu chuẩn xuống, thu mẫu hoặc kết hợp dùng ống nhòm để quan sát sâu chi tiết hơn. Ngoài ra điều tra quan sát gián tiếp: áp dụng một số phương pháp truyền thống như: tìm sự hiện diện của sâu qua dấu vết của sâu non tuổi nhỏ ăn lá nõn làm héo ngọn; phát hiện cành lá bị sâu non tuổi lớn cắn trụi hay xác sâu còn lưu lại trên cành; phát hiện qua phân sâu rơi dưới tán nằm trên đất và thảm mục; phát hiện sâu dựa vào sự hiện diện và mức độ tập trung của các loài thiên địch (Nguyễn Thế Nhã và Trần Văn Mão, 2005).
Thời gian tiến hành: Điều tra phát hiện và thu thập mẫu vật đƣợc tiến hành trong các năm 2013-2015, mỗi năm 4 đợt, đợt 1 từ đầu tháng 2-4, đợt 2 từ tháng 5- 7, đợt 3 từ tháng 8 - 10, đợt 4 từ tháng 10-1 năm sau.
Xử lý, bảo quản mẫu vật và ịnh loại: Các mẫu vật đƣợc thu thập xử lý bảo quản theo phương pháp điều tra chuyên đề về côn trùng rừng của Nguyễn Thế Nhã và cs (2000, 2001). Phân chia từng mẫu vật thu đƣợc qua từng nhóm nhỏ thông qua các dấu hiệu phân biệt rõ ràng về hình thái như màu sắc, kích thước, hình dạng của sâu non, nhộng, trưởng thành. Trong từng nhóm, tiếp tục so sánh đối chiếu tỷ mỷ các chi tiết để kiểm tra sự đồng nhất hay khác biệt có chụp ảnh màu minh họa.
Sau khi đã có đầy đủ dữ liệu quan sát về hình thái từng loài và nhóm loài, tiến hành phân loại theo khóa phân loại của Alexander Monastyrskii, Alexey Devyatkin (2001) do Khuất Đăng Long dịch và tài liệu của tác giả Lý Thành Đức (2006) về Phân loại côn trùng rừng, đồng thời đối chiếu với tài liệu tra cứu: sinh vật rừng Việt Nam (phần: côn trùng rừng).
Công thức tính: Mức độ xuất hiện của các loài đƣợc đánh giá theo tần suất bắt gặp nhƣ sau:
Độ thường gặp (%) =
Số lần bắt gặp loài sâu hại hồi
x 100 (1) Tổng số lần điều tra
Độ thường gặp của loài sâu hại hồi được đánh giá theo thang bậc sau:
- : Tần suất bắt gặp dưới 5%
+ : Tần suất bắt gặp 5 - 25%
++ : Tần suất bắt gặp > 25 - 50%
+++ : Tần suất bắt gặp > 50%
2.5.1.2. Đ c i m hình thái và gây hại của một s loại sâu hại quan trọng trên cây hồi Miêu tả c i m hình thái: Thu thập ổ trứng của một số loài sâu hại quan trọng trên cây hồi từ ngoài rừng về, để ẩm bằng bông thấm nước trong đĩa petri.
Theo dõi trứng nở từng ngày, sau khi trứng nở ra sâu non đƣợc nuôi bằng thức ăn lá hồi (tùy theo mỗi loại sâu hại để chọn lá non hay lá già) để thu các pha phát dục cho đến khi trưởng thành giao phối và đẻ trứng. Các mẫu thu được nhằm phục vụ cho nghiên cứu đặc điểm hình thái. Lấy một số cá thể sâu non, đủ các tuổi như: tuổi 1, tuổi 2, tuổi 3,.v.v. tiền nhộng, nhộng, trưởng thành (đực, cái) đƣợc đem làm mẫu, theo dõi, chụp ảnh và mô tả đặc điểm.
2.5.1.3. Điều tra, thu thập xác ịnh thành phần thiên ịch trên cây hồi
Thực hiện theo phương pháp điều tra cơ bản sâu bệnh của Viện BVTV (1997). Điều tra thu thập định kỳ 10 ngày/lần. Quan sát bằng mắt để phát hiện các loài thiên địch. Thu những mẫu bọ ánh kim Oides sp. bị chết do các bệnh khác nhau. Vợt những thiên địch biết bay hoặc bắt tay đối với những thiên địch hoạt động chậm chạp.
Tiến hành thu thập toàn bộ mẫu bọ ánh kim Oides sp. các pha (gồm pha trứng, sâu non, trưởng thành), riêng với mẫu vật là sâu non tiến hành nuôi tới trưởng thành để phân loại. Đối với mẫu vật bị ký sinh hoặc nghi ngờ bị ký sinh đem về cho vào ống nghiệm sạch theo dõi tiếp cho tới khi trưởng thành ký sinh xuất hiện.
Đối với côn trùng là thiên địch có kích thước tương đối lớn có thể cắm kim.
Đối với côn trùng có kích thước nhỏ thì ngâm trong cồn 75%, hoặc để khô trong ống nghiệm nhỏ. Đối với nhện, rệp thì ngâm trong cồn 75%. Các chủng nấm có ích thu đƣợc bảo quản dựa trên kỹ thuật truyền thống và khóa phân loại của Barnett (1960).
Các mẫu thiên địch thu đƣợc định loại nhờ sự giúp đỡ của các chuyên gia trong nước và ngoài nước (trường đại học quốc gia SEOUL, Đại học Nông nghiệp và Khoa học sự sống Hàn Quốc, các chuyên gia tại Viện Động vật học Bắc Kinh Trung Quốc).
Công thức tính ộ th ờng g p: Nhƣ công thức ở mục 2.5.1.1 2.5.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của loài bọ ánh kim Oides sp.
2.5.2.1. Xác ịnh loài bọ ánh kim Oides sp. hại cây hồi
Ph ơng pháp tiến hành: Theo phương pháp của Viện Bảo vệ thực vật (1997).
Bọ ánh kim Oides sp. thu thập ở giai đoạn trưởng thành hoặc thu các giai đoạn phát dục trước trưởng thành mang về phòng tiếp tục nuôi cho đến khi nhộng vũ hóa thành trưởng thành. Trưởng thành được cho vào tủ lạnh ở nhiệt độ 0oC từ 6 đến 8 giờ cho trưởng thành chết và làm mẫu. Loài BAK gây hại được xác định theo khóa phân loại của tác giả Kimoto, Gressitt (1963), trường đại học quốc gia SEOUL, Đại học Nông nghiệp và Khoa học sự sống Hàn Quốc, các chuyên gia tại Viện Động vật học Bắc Kinh Trung Quốc, chuyên gia phân loại tại Bảo tàng Lịch sử Tự nhiên Vương quốc Anh.
Việc xác định tên khoa học cho loài BAK hại cây hồi đƣợc dựa chủ yếu vào các khóa phân loại hình thái, có phối hợp kỹ thuật công nghệ sinh học tiên tiến.
2.5.2.2. Đặc điểm hình thái của bọ ánh kim Oides sp.
* Ph ơng pháp thu bắt nhân nuôi bọ ánh kim
Ph ơng pháp tiến hành: Theo phương pháp của Viện Bảo vệ thực vật (1997).
Thu sâu non tuổi lớn và nhộng bọ ánh kim đồi mồi Oides sp. ở ngoài rừng hồi tại Tân Đoàn, Văn Quan, Lạng Sơn về nuôi trong phòng thí nghiệm theo phương pháp nuôi tập thể (10 cá thể trong hộp nhựa hình khối chữ nhật có kích thước 20 × 10 × 15cm (dài×rộng×cao), trong có lót giấy hút ẩm và cành hồi sạch có quấn bông vào cuống
giữ ẩm để làm thức ăn. Hàng ngày quan sát và thay thức ăn mới 01 ngày một lần cho đến khi chúng ngừng ăn và chuyển giai đoạn tiền nhộng. Lấy đất và cát ẩm trộn lẫn lót ở dưới đáy hộp dầy 10cm để chúng chui xuống chuyển nhộng. Theo dõi cho đến khi chúng vũ hoá trưởng thành. Từng cặp trưởng thành đực, cái vũ hóa cùng ngày được tách riêng vào lồng có kích thước 60×60×80 (cm) (dài x rộng x cao) trong lồng có các cây hồi con 2-3 năm tuổi (2-3 cây với chiều cao 30-50 cm) để chúng ăn và giao phối đẻ trứng. Hàng ngày theo dõi trứng trên các chãng cành trong lồng ghép đôi, để quan sát ổ trứng. Hai ngày lại thay cây hồi mới một lần, những cây hồi thay ra nếu có ổ trứng sẽ được đánh dấu và ghi lại ngày giờ đẻ trứng và thường xuyên chăm sóc cây hồi có ổ trứng để cây không bị chết cho tới khi trứng nở hết.
* Nghiên cứu c i m hình thái bọ ánh kim Oides sp.
- Pha trưởng thành: Những cá thể trưởng thành mới vũ hóa được cho vào ngăn đá của tủ lạnh khoảng 8-10 phút, sau đó lấy ra cắm kim, sấy khô. Mẫu khô trưởng thành được quan sát dưới kính lúp soi nổi để mô tả màu sắc, đặc điểm cánh và đo kích thước của 30 cá thể (15 cá thể đực, 15 cá thể cái).
- Pha trứng: Trưởng thành (10 cá thể đực và 10 cá thể cái) bọ ánh kim Oides sp. thu được từ nhân nuôi nguồn thả vào lồng lưới trong lồng có các cây hồi con 2-3 năm tuổi (2-3 cây với chiều cao 30-50 cm) để chúng ăn và giao phối đẻ trứng. Hai ngày thay cây hồi mới một lần. Lấy những cây hồi có ổ trứng ra quan sát những ổ trứng ở trên cây. Ổ trứng bọ ánh kim đƣợc ngâm vào dung dịch KOH 10% sau 24h, trứng sẽ được tách riêng ra từng quả soi dưới kính lúp điện tử để đo và quan sát trứng. Mô tả hình dáng, màu sắc và đo kích thước 30 quả trứng.
- Pha sâu non: Những sâu non nở cùng ngày đƣợc nuôi riêng rẽ từng cá thể trong hộp nhựa có kích thước 10x10 (cm) (đường kính x chiều cao) với thức ăn ngọn cây hồi. Thức ăn phải sạch sẽ, không dính nước mưa, phù hợp với nhu cầu tự nhiên của BAK. Hằng ngày thay thức ăn mới, quan sát cho đến khi lột xác chuyển tuổi. Thí nghiệm tương tự với các tuổi tiếp theo. Mỗi pha đều quan sát mô tả, chụp ảnh, đo kích thước (dài, rộng). N ban đầu 100 cá thể. Thu số liệu xử lý là 30 cá thể.
Hàng ngày đo 10 cá thể từ ngày thứ nhất sau lột xác đến ngày trước khi lột xác chuyển tuổi. Chiều dài đo từ đầu đến đốt cuối bụng, chiều rộng đo ngang ngực.
- Pha nhộng: Khi sâu non đẫy sức hóa nhộng, quan sát, mô tả màu sắc và đo kích thước 30 cá thể. Chiều dài đo từ mút đầu đến mút cuối, chiều rộng đo chỗ rộng nhất của ngực.
2.5.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh vật học bọ ánh kim Oides sp.
Phương pháp tiến hành: Theo phương pháp nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật (1997).
* Xác ịnh kí chủ phụ của bọ ánh kim Oides sp.
Để xác định ký chủ phụ của bọ ánh kim, chúng tôi đã dựa vào ký chủ là cây hồi và những cây cùng họ thực vật với các loài cây là kí chủ và những cây xung quanh địa điểm bọ ánh kim gây hại để thử nghiệm.
Thí nghiệm được bố trí 80 công thức (tương ứng 80 loài thực vật cùng họ và những loài thực vật xung quanh địa điểm rừng hồi.
Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 10 sâu non tuổi 2 cho vào các hộp nhựa có kích thước 25 x 15x 10cm (dài x rộng x cao) trong đặt 3 cành non của các cây làm thí nghiệm. Hàng ngày thay thức ăn và theo dõi ăn, thời gian sống sót của từng cá thể bọ ánh kim Oides sp. sau 1, 2, 3, 4 và 5 ngày.
Công thức tính: Tỷ lệ sâu sống nhƣ sau:
Tỉ lệ (%) số sâu sống =
Số sâu còn sống
x 100 Tổng số sâu làm thí nghiệm
Ghi chép số liệu để xác định ký chủ phụ.
* Nghiên cứu c i m sinh học và một s tập tính hoạt ộng của sâu non bọ ánh kim Oides sp.
+ Tỷ lệ trứng nở của bọ ánh kim Oides sp. trong phòng
Thả BAK trưởng thành vào lồng có kích thước 60×60×80 (cm) (dài x rộng x cao) 5 cặp BAK/ 1 lồng, trong mỗi lồng có 5 cây hồi con 3 năm tuổi đã chuẩn bị trước để BAK ăn và đẻ trứng. Đặt các lồng trong phòng thí nghiệm. Hàng ngày theo dõi các lồng và thu những ổ trứng BAK đẻ cùng ngày trên các cây hồi con.
Lấy những cây hồi con có trứng BAK để riêng ra một vị trí khác đƣợc đánh dấu, đeo thẻ và thường xuyên chăm sóc cho cây hồi sinh trưởng bình thường. Theo dõi tỷ lệ trứng nở hằng ngày trên cây hồi con vào 2 thời điểm 9h sáng và 16h chiều.
Thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần 20 ổ trứng. Điều kiện nhiệt độ, độ ẩm ở phòng nuôi sâu bán tự nhiên.
+ Nghiên cứu thời điểm trứng BAK xuất hiện và trứng nở ở điều kiện tự nhiên.
Theo dõi các ổ trứng xuất hiện ở các thời điểm khác nhau trên cây hồi ngoài rừng hồi của xã Tân Đoàn, huyện Văn Quan, Lạng Sơn: Đánh số thẻ từng ổ, ghi ngày giờ trứng xuất hiện. Theo dõi thời điểm trứng nở và thời gian nở của trứng. Theo dõi trong 2 năm, mỗi năm 30 ổ trứng. Ghi lại ngày giờ sâu non xuất hiện của từng ổ trứng trên cây hồi.
+ Nghiên cứu tập tính hoạt động của sâu non và triệu chứng gây hại - Tập tính hoạt động của sâu non
Quan sát trứng nở, sâu non tuổi 1 bằng kính lúp, từ tuổi 2, tuổi 3 quan sát bằng mắt thường cả trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng. Hàng ngày quan sát tập tính ăn sự di chuyển, chuyển màu sắc của từng cá thể khi mới nở và khi mới lột xác chuyển tuổi.
- Triệu chứng gây hại của BAK
Nghiên cứu, quan sát, sâu chui ra khỏi tổ, sự di chuyển lên búp, hoa, quả, thu thập chụp ảnh trên các rừng hồi những vết lá bị hại, hình ảnh về triệu chứng các búp ngọn, lá, hoa và quả bị BAK gây hại.
* Nghiên cứu c i m sinh học và một s tập tính h a nhộng của bọ ánh kim.
Vị trí hóa nhộng
Khi sâu non bọ ánh kim cuối tuổi 3 đẫy sức, theo dõi hành vi tìm kiếm vị trí hóa nhộng của chúng trên các bộ phận: lá, hoa, gốc cây, bụi cỏ, vết nứt của đất để xác định. Ngoài ra, gắn bẫy dính vàng xung quanh thân, căng nilon xung quan gốc, đặt các chậu nước xung quanh gốc để theo dõi cách di chuyển của sâu non tìm vị trí vào nhộng.
* Nghiên cứu c i m sinh học và h a tr ng thành của bọ ánh kim
+ Nhịp điệu vũ hóa trưởng thành bọ ánh kim ở ngoài tự nhiên
Sau khi bọ ánh kim vào nhộng hết, tiến hành căng lưới cước xung quanh vị trí vào nhộng dưới đất (dưới tán cây hồi). Thí nghiệm gồm 3 công thức, mỗi công thức 10 cây. Theo dõi, đếm số trưởng thành vũ hóa hàng ngày cho tới khi kết thúc.
+ Tỷ lệ vũ hóa và giới tính của bọ ánh kim - Ở ngoài rừng hồi:
Thu sâu non tuổi lớn ở ngoài đồng về nuôi tập thể cho tới khi vào nhộng, đến vũ hóa trưởng thành, quan sát kích thước, mầu sắc và bộ phận sinh dục của chúng để xác định giới tính. Ghi chép số liệu để tính tỷ lệ vũ hóa, tỷ lệ đực cái.
- Ở trong phòng thí nghiệm:
Toàn bộ sâu non nuôi trong phòng thí nghiệm đều theo dõi đến khi vào nhộng, vũ hóa trưởng thành quan sát kích thước và bộ phận sinh dục của chúng để xác định giới tính. Ghi chép số liệu để tính tỷ lệ vũ hóa, tỷ lệ đực cái.
* Thời gian phát dục các pha của bọ ánh kim Oides sp.
Theo dõi thời gian phát dục của bọ ánh kim đƣợc theo dõi ở 2 địa điểm: 1.
Viện Bảo vệ thực vật nuôi ở trong 2 phòng bật điều hòa nhiệt độ (phòng 1 ở nhiệt độ 23oC, ẩm độ 70%, phòng 2 nhiệt độ 28oC, ẩm độ 80%; 2. Tại xã Tân Đoàn huyện Văn Quan ở điều kiện nhiệt độ thường, kỹ thuật nuôi ở 2 nơi là như nhau.
- Pha trứng: Kiểm tra những cây hồi có trứng, những cành cây có trứng đƣợc đẻ cùng ngày xếp vào một vị trí và đánh số ký hiệu, chăm sóc cho cây hồi sinh trưởng bình thường. Hằng ngày quan sát 2 lần (sáng 8-9h, chiều 16-17h) cho tới khi trứng nở. Quan sát ghi lại những ổ trứng nở và chuyển các sâu non mới nở sang các hộp nhựa nhỏ có lót giấy ẩm và ngọn hồi sạch, quấn bông thấm nước ở cuống ngọn hồi để giữ tươi, mỗi hộp một sâu non. Ghi chép thời gian trứng nở, số trứng nở/ ổ theo dõi, điều kiện nhiệt độ, độ ẩm. Tổng số ổ trứng theo dõi là 30 ổ.
- Pha sâu non: Những trứng nở cùng ngày đƣợc chuyển sang các hộp nhựa có kích thước 10x10 (cm) (đường kính x chiều cao) để nuôi sâu, trong mỗi hộp có búp hồi non được giữ ẩm bằng bông thấm nước, quấn vào cọng búp. Mỗi ngày thay búp hồi và vệ sinh hộp một lần. Búp hồi phải sạch sẽ, không dính nước,