CHƯƠNG 2: KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM
2.4. Các phương pháp đặc trưng
2.4.6. Phương pháp đánh giá độc tính của chất lỏng từ lên tế bào ung thư và tế bào lành
Để thử độc tính của hệ chất lỏng từ Fe3O4@CS trên dòng tế bào ung thư Sarcoma180 nuôi cấy, bộ kit CellTiter 96® Non-Radioactive CellProliferation Assay của hãng Promega (gọi tắt là phương pháp MTT) được sử dụng. Phương pháp MTT có ưu điểm là độ nhạy và độ chính xác cao, các bước thực hiện đơn giản, trong thời gian ngắn, do đó thường sử dụng kiểm tra độc tính để sàng lọc thuốc với số lượng lớn, trên nhiều nồng độ thuốc khác nhau. Kết quả thu được cho ra giá trị IC50, từ đó đánh giá được độ độc của thuốc cần nghiên cứu.
Dựa vào giá trị mật độ quang học, ta xác định được % tỷ số tăng sinh (A) của tế bào, từ đó đánh giá được độ độc đối với tế bào của chế phẩm. A được tính theo công thức:
𝐴% = 𝑇𝐻 − 𝑇𝑍 𝑉𝐻 − 𝑇𝑍
Trong đó: VH Giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung môi TH: Giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với mẫu
Tz: Giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng nuôi tế bào ở thời điểm zero lúc bắt đầu tra mẫu để thử.
Dựa vào giá trị A (%) ứng với dải nồng độ ta sẽ vẽ được đồ thị theo logarit và thu được phương trình của A (%) (trục y) theo nồng độ (trục x): y = f(x) gọi là đường cong đáp ứng liều. Khi y = 50% thì x = IC50 (Inhibited Concentration) là nồng độ gây ức chế sự sinh trưởng 50%. Hầu hết các nghiên cứu độc tính của thuốc đối với tế bào đều sử dụng giá trị IC50 để đánh giá. IC50 là giá trị tại 1 điểm trên trục x tương ứng với giao điểm của đường thẳng P và đường cong đáp ứng liều. Nếu A = 50% tương đương với việc chế phẩm đem thử đã ức chế tăng sinh tế bào 50% so với đối chứng IC50%
(inhibitory concentration). Nếu A = 0% (T =Tz) tương đương với việc chế phẩm đã ức chế toàn bộ quá trình tăng sinh tế bào. Nếu A < 0% (T < Tz) tương đương với việc chế phẩm thử gây độc và làm chết tế bào. Liều mà tại đó giá trị A= - 50% được gọi là liều gây độc và làm chết 50 % tế bào ban đầu, kí hiệu là IC50% (cytotoxicity Index).
Hình 2.17. Xác định giá trị IC50 trực tiếp dựa vào đồ thị đáp ứng liều của các dòng tế bào khi thử thuốc với các nồng độ khác nhau
Theo phương pháp của Skehan &cs. (1990) và Likhitwitayawuid&cs. (1993) được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Hệ chất lỏng từ Fe3O4@PMAO được thử nghiệm đánh giá độc tính trên các dòng tế bào lành và tế bào ung thư khác nhau.
Dòng tế bào (cell lines)
+ Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma - Ung thư gan) + Dòng RD (Human rhabdomyosarcoma - Ung thư mô liên kết) + Dòng MCF-7 (Human breast adenocarcinoma - Ung thư vú) + Dòng Vero (Vero cells - Tế bào biểu mô thận khỉ)
Môi trường và các dụng cụ, hóa chất:
Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) có bổ sung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penicillin- Streptomycin sulfate - Fungizone); NAA (Non- Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum); Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic.
Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu týp cho micropipet…
Chất chuẩn chứng dương tính:
+ Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipticine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO
Tính kết quả:
- Kết quả được đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495 - 515nm.
- Giá trị CS (Cell Survival): là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chứng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức:
𝐶𝑆% = OD (mẫu) − OD (ngày 0)
OD (DMSO) − OD (ngày 0) 𝑥 100
- Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ
𝜎 = √(∑(𝑥𝑖 − 𝑥̅)^2)/(𝑛 − 1)
- Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50.
Giá trị IC50 (50% Inhibitory Concentration) là nồng độ của mẫu thử mà tại đó ức chế được 50% số lượng tế bào nghiên cứu. Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang gía trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thửđể tính giá trị IC50.
1/y = a + blnX