- Dựa vào các tài liệu ,Dược điển ,thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hay các loại cột khác nhau.
Chúng ta thông thường dùng 02 loại cột pha thuận ( NP) và cột pha đảo ( RP). Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác như cột CN
,cột NH2 ,....
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email: hoangthinh6@gmail.com
Chọn Ðiều kiện sắc ký
Cột pha thuận ( NP): Silicagel trung tính
Pha tĩnh :Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực .Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước .
Ví dụ cột Lichrosorb Si 40,Si 60... Cấu tạo cột như sau :
OH OH OH
- O - Si - O - Si - O - Si - O -
OH OH OH
Pha động : dùng cho loại này là các dung môi không phân cực hay ít phân cực như : Methanol,Benzen,Acetonitril,Chloroform ...
Cột pha đảo ( RP) : ( Silicagel đã Alkyl hóa )
Dùng để tách các chất không phân cực ,ít phân cực ,các chất phân cực có thể tạo cặp Ion .Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch Carbon thẳng ( C8 hay C18 tương đương RP 8 hay RP 18) hay các mạch Carbon vòng ( Phenyl- tương đương cột Phenyl ) vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít .
Ví dụ như cột Lichrospher RP 8 ..ODS , Cột Nucleosil 18....
Chọn Ðiều kiện sắc ký
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email: hoangthinh6@gmail.com
Pha động : Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực như :Methanol, Acetonitril, nước hay các loại dung dịch đệm ,hỗn hợp của các dung môi-đệm.
Pha động có thể làm thay đổi : + Độ chọn lọc + Thời gian lưu
+ Hiệu năng tách của cột + Độ phân giải
+ Tính đối xứng của Peak
Chọn Ðiều kiện sắc ký
Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích . Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau : + Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có .Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học . ( vd giá trị pH : 2.5< pH <8.5)
+ Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng (đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột ,hay pha động có sẵn trong cột. Vd : đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column)
+ Pha động phải bền vững theo thời gian : càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gian phân tích mẫu ).
+ Phải có độ tinh khiết cao : dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích .
+Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064. Email: hoangthinh6@gmail.com + Phải phù hợp với loại Detector : vd UV - VIS thì dung môi không được hấp thụ quang (vd acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm) . Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang.
+ Phải kinh tế ,không quá hiếm và đắt.
Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC) pha động là dung môi phân cực là : Nước,ACN,MeOH ,acid hay Base hữu cơ và một vài Amin hay Aminoacid..
+ Do sự thêm nước vào dung môi hữu cơ tạo thành một pha động phân cực hơn chất hữu cơ nguyên một mình nó .Vd thêm nước vào ACN hay MeOH ..
Sẽ tạo được pha động phân cực hơn nó . Tất nhiên độ phân cực phụ thuộc vào tỷ lệ nước được thêm vào.
+ Ngoài các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm pH để ổn định pH.Chất tạo phức,tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất .
+ Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải E của dung môi theo bảng sau:
BẢNG ĐỘ PHÂN CỰC CỦA MỘT SỐ DUNG MÔI
1. n-Hexan 0.1