e) Các chất bổ sung
3.3.Hóa chất và thiết bị
3.3.1. Hóa chất
- Hóa chất khử trùng (C2H5OH, NaClO, HgCl2)
- Môi trường cơ bản (MS, WPM, B5) - Saccharose
- Agar
- Than hoạt tính, PVP (polyvinyl pyrolidone)
- Các chất điều hòa sinh trưởng: BA, Kinetine, GA3, α-NAA,
- Các chất điều chỉnh pH: HCl 1M, NaOH 1M
3.3.2. Thiết bị
- Máy khuấy từ
- Cân phân tích 10-4, cân kỹ thuật 10-2
- Bếp ga - Lò vi sóng - Tủ sấy
- Nồi hấp vô trùng - Tủ cấy vô trùng
3.4. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2
0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.).
- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (MS, B5,
WPM) đến khả năng tái sinh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.).
- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng GA3 đến khả năng bật
chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.).
- Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BA; BA kết hợp với
Kinetine đến quá trình nhân nhanh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.).
- Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra
rễ của cây Khoai mỡ (Dioscorea alata L.).
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1
- Phương pháp tạo vật liệu vô trùng:
+ Mẫu sử dụng nuôi cấy là các đoạn thân non bánh tẻ được rửa bằng dung dịch xà phòng loãng, sau đó rửa sạch dưới vòi nước, tiếp tục tráng lại bằng nước cất vô trùng 3-4 lần.
+ Khử trùng mẫu: Mẫu sau khi được làm sạch bụi bẩn, cắt thành các đoạn
ngắn, đưa vào bình tam giác (250 ml) vô trùng. Lắc mẫu trong dung dịch cồn 700
trong 1 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần cho sạch cồn và bụi bẩn trong
box cấy. Tiếp tục bổ sung chất khử trùng HgCl2 0,1%, thời gian khử trùng: 0, 3, 5, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7, 10, phút. Kết thúc thời gian khử trùng dùng nước cất vô trùng rửa sạch mẫu 3-5 lần. Tiếp đó, ngâm mẫu trong nước cất vô trùng 5 phút. Sau đó mẫu được thấm khô bằng giấy thấm, sử dụng pank, dao vô trùng cắt mẫu thành các đoạn nhỏ (0,5-0,7 cm) có chứa mắt ngủ.
+ Cấy mẫu đã khử trùng vào môi trường đã chuẩn bị.
+ Sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi cấy với điều kiện: Nhiệt độ phòng:
25 ± 20C; Cường độ chiếu sáng: 2000-2500 lux; Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày;
Độ ẩm: 70 – 90%. Tiến hành theo dõi mẫu (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2
0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.)
(sau 10 ngày nuôi cấy).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 5 công thức, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình một mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Hóa chất Công thức thí nghiệm Thời gian (phút)
HgCl2 0,1% CT1 (Đ/C) 0
CT2 3
CT3 5
CT4 7
CT5 10
Chỉ tiêu theo dõi: Tiến hành theo dõi sau 10 ngày các chỉ tiêu tỷ lệ mẫu sống
không nhiễm, tỷ lệ mẫu sống nhiễm, tỷ lệ mẫu chết.
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2
- Phương pháp tái sinh in vitro:
+ Sửdụng môi trường MS, B5, WPM có bổ sung than hoạt tính 1g/l.
+ Chồi được cấy trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy
xong đưa vào phòng nuôi cấy với điều kiện: Nhiệt độ phòng: 25 ± 20C; Cường độ
chiếu sáng: 2000-2500 lux; Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày; Độ ẩm: 70 – 90%. Tiến hành theo dõi số chồi, chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (MS, B5, WPM) đến khả năng tái sinh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau 20 ngày nuôi cấy).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy 1 mẫu. Mỗi công thức bổ sung thêm than hoạt tính 1g/l. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Công thức thí nghiệm Môi trường
1 MS
2 B5
3 WPM
Chỉ tiêu theo dõi sau 20 ngày: Tỷ lệ tái sinh, chất lượng chồi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ghi chú: Môi trường thích hợp nhất xác định ở thí nghiệm này được sử dụng làm môi trường nền cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo.
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài
chồi Khoai mỡ(Dioscorea alata L.) (sau 30 ngày nuôi cấy).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 5
công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy 1 mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Công thức thí nghiệm Nồng độ GA3 (mg/l) 1 (Đ/C) MT nền + 0,0 2 MT nền + 0,1 3 MT nền + 0,3 4 MT nền + 0,5 5 MT nền + 1,0
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi.
Ghi chú: MT nền là thành phần của môi trường MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin + Inositol 0,1g /l + đường 30g /l + agar 6g /l, pH = 5,6 – 5,8) + than hoạt tính 1g/l.
3.5.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 4