Chương 5: K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ 5.1 Kết luận
A.10 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
P ư n p áp in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase d a trên nguyên tắc: -glucosidase khi g p nối -D-glucose sẽ cắt đứt nố n y để giải phóng
đường D-glucose. Hoạt động này sản sinh ra nhi u lu os s u k ăn v l m tăn m lượn lu os tron máu, o đ n ức chế hoạt động của men - lu os s để làm chậm s chuyển hoá một số loại thứ ăn t n lu os . V vậy, n ười ta sử dụng các ch t n n có liên kết v đường D-glu os n ư: p-Nitrophenyl--D- glucopyranoside, maltose;… để xây d n p ư n p áp t ử hoạt tính ức chế enzyme
-glucosidase trong phòng thí nghi m.
Hóa chất - Acarbose - Đ m pH = 7
- Dun n n p-Nitrophenyl- -D-glucopyranoside (pNP-G) - Enzyme α-glucosidase
- Na2CO3
Cách tiến hành
Dung dịch đệm phosphate pH = 7,0 (0,01 M): l y 20 mL dung d ch Na2HPO4 0,2 M và 12 mL dung d ch NaH2PO4 0,5 M v o b r 1000 mL. T m nư c c t và chỉnh đ m đến pH = 7,0, s u đ t ến n đ nh mứ đến 1000 mL.
Dung dịch nền pNP-G 3,0 mM: cân chính xác khoản 18,26 m t n n pNP-G, hòa tan trong dung d đ m p osp t , đ nh mức lên 20 mL. Bình đựng dung dịch sau đ được che kín bằng giấy bạc để tránh ánh sáng mặt trời.
Dung dịch enzyme α-glucosidase 0,2 U/mL: cân khoảng 1,0 mg enzyme α- glucosidase, hòa tan trong dung d đ m p osp t , đ n mứ l n 5 mL, t u đượ un ố . Dung dịch enzyme làm việc được pha lo ng từ dung dịch enzyme gốc với dung dịch đệm phosphate và giữ mát để đảm bảo sự ổn định của enzyme trong ngày làm việc.
Dung dịch Na2CO3 0,1 M: cân 10,62 g muối Na2CO3 k n, t n tron nư c c t và đ nh mứ đến 1000 mL.
Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme α- lu os s được th c hi n n ư s u:
- M u được hũa tan trong dung d đ m phosphate pH = 7,0 ở nồn độ 500 àg/mL - Thêm 50 L enzyme 0,1 U/mL, lắ đ u, ủ trong 5 phút tại 37oC.
- Cho tiếp 50 L dung d ch n n 1,5 mM và ủ 30 phút tại 37oC để phản ứng xảy ra.
- Sau khi ủ, thêm 375 L Na2CO3 0,1 M để dừng phản ứng.
- Dung d s u đ đượ đo qu n tạ bư c sóng 401 nm.
- M u ontrol được chu n b tư n t n ư m u thử, k đ t t y un ch m u b ng dung d đ m phosphate (m u control không chứa m u thử).
- A rbos l t đố ứn ư n .
Mỗi m u được thử ở 5 nồn độ khác nhau, mỗi nồn độ đo 3 l n. M u trắn tư n t n ư m u thử n ưn t y un ch enzyme b ng dung d đ m phosphate. Từ đ t n được giá tr ph n trăm ức chế (I%) v i từng nồn độ khảo sát là trung bình cộng của 3 giá tr mật độ qu n đo được ở mỗi nồn độ v á tr IC50, là nồn độ của m u khảo sát mà tạ đ t ể ức chế được 50% enzyme α-glucosidase.
PHỤ LỤC B – ĐƯỜNG CHUẨN CÁC PHƯ NG PHÁP PH N TÍCH
Hình B.1: Đồ thị đường chu n Trolox
trong phương pháp xác định hoạt tính kháng oxi hóa theo DPPH
Hình B.2: Đồ thị đường chu n Trolox
trong phương pháp xác định hoạt tính kháng oxi hóa theo FRAP y = 0.0394x + 0.6308
R² = 0.9972
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0 250 500 750 1000
RSA (%)
Nồng độ Trolox (àM)
y = 0.002x - 0.0228 R² = 0.9973
-0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5
0 250 500 750 1000
Độ hấp thu OD
Nồng độ Trolox (àM)
Hình B.3: Đồ thị đường chu n axit gallic
trong phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng
Hình B.4: Đồ thị đường chu n glucose trong phương pháp xác định hàm lượng đường kh
y = 0.0121x + 0.007 R² = 0.9983
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0 10 20 30 40 50 60
Độ hấp thu OD
Nồng độ axit gallic (mg/m )
y = 0.0007x - 0.0098 R² = 0.9963
-0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
0 200 400 600 800 1000
Độ hấp thu OD
Nồng độ Glucose (àg/mL)
PHỤ LỤC C – SỐ LI U THÔ VÀ XỬ LÝ SỐ LI U
1. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian rang đến hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính kháng oxy hóa của vỏ cà phê ướt sau làm khô và vỏ cà phê khô
Ảnh hưởng của thời gian rang đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa của vỏ cà phê ướt sau làm khô
Nhiệt độ 160oC
Thời gian 180 giây 210 giây 240 giây 270 giây Độ ẩm (%) 6,33 ± 0,15c 6,10 ± 0,20bc 5,80 ± 0,10ab 5,53 ± 0,21a
TPC (mgGAE/g
chất khô)
22,56 ± 0,79b 24,32 ± 1,21bc 25,88 ± 0,71c 19,33 ± 0,96a DPPH
(àmolTE/g chất khô)
213,96 ± 5,78b 230,86 ± 9,54c 246,01 ± 5,37d 175,72 ± 6,47a a-d biểu th cho s khác bi t ý n ĩ tron n một hàng (P < 0,05)
Ảnh hưởng của thời gian rang đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa của vỏ cà phê khô
Nhiệt độ 120oC
Thời gian 180 giây 210 giây 240 giây 270 giây Độ ẩm
(%) 6,23 ± 0,25c 5,93 ± 0,15bc 5,57 ± 0,15ab 5,33 ± 0,21a TPC
(mgGAE/g chất khô)
38,01 ± 1,61ab 41,29 ± 1,62c 40,71 ± 1,69bc 35,68 ± 1,55a DPPH
(àmolTE/g chất khô)
384,14 ± 20,25b 488,96 ± 20,64d 439,76 ± 17,71c 343,65 ± 24,60a a-d biểu th cho s khác bi t ý n ĩ tron n một hàng (P < 0,05)
2. Kết quả xác định IC50 của vỏ cà phê trà thành phẩm theo hoạt tính kháng oxy hóa DPPH
Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế (%I) của vỏ cà phê khô
Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế (%I) của vỏ cà phê ướt y = 13.294x + 2.5611
R² = 0.9965
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0 1 2 3 4 5 6
%I
mg chất kh /m
y = 10.335x + 1.086 R² = 0.9964
0 10 20 30 40 50 60
0 1 2 3 4 5 6
%I
mg chất kh /m
3. Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase
Dung
môi Mẫu
Phần trăm ức chế (I, %) IC50
(àg/mL) 100 (àg/mL) 50 (àg/mL) 25 (àg/mL) 10 (àg/mL)
Nước Vỏ cà phê
ướt * 97,63 ± 0,42 82,39 ± 0,35 48,75 ± 0,95 10,5 10 (àg/mL) 5 (àg/mL) 2,5 (àg/mL) 1,0 (àg/mL)
Nước Vỏ cà phê
khô 94,55 ± 0,92 79,01 ± 0,99 53,7 ± 1,3 11,88 ± 0,40 2,3 Ethanol
70%
Vỏ cà phê
khô 95,60 ± 0,51 78,3 ± 1,30 39,2 ± 1,90 3,9 ± 1,30 3,1 Ethanol
70%
Vỏ cà phê
ướt * 95,63 ± 0,58 78,54 ± 0,77 37,53 ± 0,87 1,4
Acarbose 138,4
(*) P n trăm ức chế l n n 100 (I > 100 ) (–) P n trăm ức chế n n 1 (I < 1 )