1.4.1 Enzyme pectinase
Cơ chất: Cơ chất của pectinase là các hợp chất pectin với những thành phần nhƣ protopectin, acid pectic, acid pectinic, pectate và pectinate.
Phân loại và cơ chế xúc tác:
- Pectinesterase ( PE) (EC.3.1.1.11) : enzyme xúc tác thủy phân liên kết este trong phân tử pectin, làm giảm mức độ ester hóa của cơ chất và giải phóng ra methanol. Chế phẩm PE thường được ứng dụng trong sản xuất pectin để tạo ra sản phẩm với những mức độ ester hóa khác nhau. Ngoài ra, enzyme này con đƣợc sử dụng để tách pectin ra khỏi nước trái cây nhằm mục đích làm tăng độ trong của sản phẩm.
- Polygalacturonase (PG): bao gồm có ba enzyme:
Endo PG (EC.3.2.1.15): thủy phân liên kết α-1,4- glycoside tại những vị trí ở giữa mạch của phân tử acid pectic hay acid pectinic.
Exo PG (EC.3.2.1.67): thủy phân liên kết α-1,4- glycoside từ đầu không khử của phân tử acid pectic hay acid pectinic và tạo sản phẩm là D-galacturonate.
Exo PG (EC.3.2.1.82): thủy phân liên kết α-1,4- glycoside đầu không khử của phân tử acid pectic hay acid pectinic và tạo sản phẩm là digalacturonate.
- Polymethylgalacturonase (PMG): đƣợc phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào vị trí phân cắt liên kết α-1,4 ở trong hay ở cuối và đầu mạch.
Endo PMG: thủy phân liên kết α-1,4- glycoside tại những vị trí ở giữa mạch phân tử pectin.
Exo PMG: thủy phân liên kết α-1,4- glycoside từ đầu không khử của phân tử pectin và tạo ra sản phẩm là galacturonate.
- Pectin transeliminase: những enzyme này xúc tác phản ứng phân giải lien kết α- 1,4 glycosid trong các hợp chất pectin không có sự tham gia của nước. Hệ enzyme này cũng chia làm hai nhóm:
Polygalacturonatelyase (PGL): gồm hai enzyme:
HVTH: Nguyễn Thị Việt Hải Trang 14 Endo PGL (EC.4.2.2.2): xúc tác trên cơ chất là acid pectic hay acid pectinic, lien kết bị phân hủy nằm ở những vị trí giữa mạch phân tử cơ chất.
Exo PGL (EC.4.2.2.9): xúc tác trên cơ chất là acid pectic hay acid pectinic, lien kết bị phân hủy nằm ở vị trí đầu không khử của cơ chất.
Polymethylgalacturonatelyase (PMGL) gồm các enzyme:
Endo PMGL (EC.4.2.2.10): xúc tác trên cơ chất là pectin, liên kết bị phân hủy nằm ở vị trí giữa mạch của phân tử cơ chất.
Exo PMGL: xác tác trên cơ chất là pectin, liên kết bị phân hủy nằm ở vị trí đầu không khử của phân tử cơ chất.
Ngoài ra, hệ pectinase còn có những enzyme thủy phân hoặc phân hủy liên kết α- 1,4-glycoside trong các oligo-D-galacturonate.
Hình 1.3: Vị trí phân cắt của các enzyme pectinase Nguồn thu nhận enzyme pectinase:
Từ thực vật: Pectinase có nhiều trong lá, thân, củ và quả thực vật nhƣ củ khoai tây, củ cà rốt, trong quả café, quả táo, vỏ cam, vỏ bưởi…nhưng ở thực vật người ta chỉ tìm thấy enzyme pectinesterase.
HVTH: Nguyễn Thị Việt Hải Trang 15 Từ vi sinh vật: có rất nhiều loại enzyme pectinase. Vi sinh vật phân giải pectin hầu nhƣ có mặt ở các đại diện nhƣ nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.
Nấm mốc: Aspergillus niger, Asp. Oryase, Asp.terreus, Asp.saito, Asp.japonicus.
Nấm men: Saccharomyces ellipsoideus, Sac.fragilus, Sac.ludwigii.
Vi khuẩn: Bactero polymixa, Bac.felseneus, Clostridium roseum…
1.4.2 Enzyme cellulose [37, 10, 14, 21, 39]
Cơ chất
Cơ chất chủ yếu của enzyme cellulase là cellulose. Cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật. Cellulose là một homopolymer đƣợc cấu tạo bởi một chuỗi dài các gốc α-D-glucose thông qua liên kết α-1,4-D-glycoside, mạch thẳng, không phân nhánh.
Hình 1.4: Công thức cấu tạo của cellulose
Trong tự nhiên, cellulose thường ở dạng kết hợp với hemicellulose và ligin hình thành nên một cấu trúc bền vững, giúp chống đỡ các tế bào thực vật. Điều này ảnh hưởng nhiều đến sự thủy phân cellulose của enzyme cellulase. Enzym cellulase có thể thủy phân một số dẫn xuất của cellulose nhƣ CMC, HEC…
Phân loại
Theo phân loại của hội sinh học phân tử và sinh học quốc tế IUBMB, enzyme này đƣợc phân thành 3 loại nhƣ sau:
Endocellulase (Endoglucanase, EG, EC 3.2.1.4). Enzyme này có khả năng thủy phân liên kết α -1,4-glycoside một cách ngẫu nhiên bên trong chuỗi cellulose để giải phóng cellodextrin, cellobiose và glucose, nó tác động mạnh trong vùng vô định hình và thể hiện hoạt tính thấp khi thủy phân cellulose tinh thể.
HVTH: Nguyễn Thị Việt Hải Trang 16 Hình 1.5: Cơ chế hoạt động của Endocellulase
Exocellulase (Cellobiohydrolase, exo-α-1,4-glucanase, EC 3.2.1.91). Enzyme này thủy phân liên kết α-1,4-glycoside từ đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose, enzyme này không thủy phân dạng cellulose kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, góp phần hỗ trợ cho enzyme Endocellulase phân giải chúng dễ dàng hơn.
Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của Exocellulase
Cellobiase (α -glucosidase, EC 3.2.1.21). Enzyme này thủy phân cellobiose và các cello-oligosaccharide mạch ngắn tạo thành glucose. Cellobiase không thủy phân đƣợc các sợi cellulose.
Hình 1.7: Cơ chế hoạt động của Cellobiase
HVTH: Nguyễn Thị Việt Hải Trang 17 Cơ chế thủy phân cellulose của enzyme cellulase
Quá trình thủy phân cellulose diễn ra trong nhiều bước và phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme: endocellulase, exocellulase, cellobiase. Nếu thiếu một trong ba loại enzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng.
Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế hoạt động của cellulase, trong đó cách giải thích do Erikson đƣa ra đƣợc nhiều công nhận hơn cả. Theo Erikson và cộng sự (1980), cơ chế tác động hiệp đồng của endocellulase, exocellulase, cellobiase nhƣ sau:
Đầu tiên endocellulase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt các liên kết α -1,4-glucoside và tạo ra các đầu mạch tự do.
Tiếp theo exocellulase tấn công cắt ra từng đoạn cellobiose từ các đầu mạch tự do đƣợc tạo thành.Kết quả tác động của endocellulase và exocellulase tạo ra các cello- oligosaccharide mạch ngắn, cellobiose, glucose.
Cuối cùng, enzyme cellobiase tiếp tục thủy phân các cello-oligosacchaside mạch ngắn thành glucose.
Hình 1.8: Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson và cộng sự 1980
HVTH: Nguyễn Thị Việt Hải Trang 18 Nguồn thu nhận enzyme cellulase
Enzyme cellulase là hệ enzyme khá phổ biến ở hầu hết các vi sinh vật có trong tự nhiên, bao gồm nấm mốc, xạ khuẩn và cả vi khuẩn. Nhiều nghiên cứu thu nhận enzyme cellulase từ các nguồn kể trên đã đƣợc thực hiện.
Cellulase đƣợc tạo thành từ nấm: Đối tƣợng chủ yếu trong các nghiên cứu về cellulase hiện nay thường là nấm. Một số loài nấm đã tổng hợp cellulase có hoạt tính khá cao đáng chú ý là: Aspergillus flavus, Asp.Niger, Asp. Awamori, Trichoderma reesei…
Cellulase từ động vật nguyên sinh: Diplodium dentiulatum…
Cellulase từ một số loài vi khuẩn: Pseudomonas fluorescens var cellulose, Acetobacter xyli-num, Cellulomonos, Cellvibrio gilvus…
Cellulase từ xạ khuẩn nhƣ: Actimimyces coelicolor, Actimimyces cellulosae, Actimimyces hydroscopicus, Actimimyces bovis…
Động vật: Ở các loài động vật ăn cỏ (trâu, bò, ngựa, cừu…) trong dạ cỏ của chúng có một hệ vi sinh vật đặc biệt có khả năng tiết ra enzyme cellulase để phân giải cellulose trong rơm, rạ, cỏ thành đường dễ tiêu hóa. Một số loại vi khuẩn trong dạ cỏ có khả năng tiết ra cellulase mạnh nhƣ là: Ruminococcus albus, Cillbacterium- cellulosolvens…