CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.6 Các phương pháp phân tích
2.6.1 Phương pháp xác định hiệu suất thu hồi chất khô
Bã dứa tươi sau khi được nghiền nhỏ được chia thành hai phần. Một phần được đem xác định độ ẩm, một phần đƣợc đem đi thủy phân. Phần đem đi thủy phân đƣợc pha loãng với nước theo điều kiện khảo sát sau đó cho vào các becher với khối lượng 20g mỗi becher. Mỗi mẫu đƣợc chỉnh pH bằng acid citric và natri cacbonat theo điều kiện khảo sát rồi cho chế phẩm enzyme vào, thay đổi hàm lƣợng chế phẩm enzyme theo điều kiện khảo sát. Tiếp theo, ủ mẫu trong bể điều nhiệt với nhiệt độ và thời gian thay đổi theo điều kiện khảo sát. Sau quá trình ủ, mẫu đƣợc gia nhiệt lên 80oC trong vòng 5 phút rồi làm nguội nhanh về nhiệt độ phòng để vô hoạt enzyme. Sau đó, mẫu đƣợc đem đi lọc chân không, tiến hành rửa bã nhiều lần rồi sấy khô bã đến khối lƣợng không đổi nhằm xác định hàm lƣợng chất khô còn lại trong bã, từ đó suy ra hàm lƣợng chất khô thu đƣợc trong phần dịch lọc thu đƣợc và hiệu suất thu hồi chất khô.
Hiệu suất thu hồi chất khô đƣợc tính theo công thức:
( )
( ) , % Trong đó:
m: khối lƣợng nguyên liệu ban đầu (1g) : độ ẩm nguyên liệu, g
m1 : khối lƣợng bã khô tuyệt đối, g
2.6.2 Phương pháp xác định hiệu suất sử dụng đường
Vi sinh vật sử dụng đường làm cơ chất để sinh trưởng và phát triển nên hàm lượng đường sẽ giảm theo thời gian.
Hiệu suất sử dụng đường:
HVTH: Nguyễn Thị Việt Hải Trang 35 Trong đó:
m1: Hàm lượng đường ban đầu
m2: Hàm lượng đường sót sau quá trình lên men
2.6.3 Phương pháp xác định hàm ẩm [TCVN5613-91] (Phụ lục 1) 2.6.4 Phương pháp xác định đường tổng (Phụ lục 2)
2.6.5 Phương pháp xác định đường khử (Phụ lục 3)
2.6.6 Phương pháp xác định nitro tổng bằng phương pháp Kjeldahl [AOAC 960.52)] (Phụ lục 4)
2.6.7 Phương pháp xác định tro tổng bằng phương pháp đốt cháy ở nhiệt độ cao [TCVN 5611 – 91] (Phụ lục 5)
2.6.8 Phương pháp xác định pH
Sử dụng máy đo pH của phòng thí nghiệm Hóa Thực Phẩm trường Đại Học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh.
2.6.9 Phương pháp xác định hàm lượng acid lactic
Nguyên lý:Dùng một dung dịch kiểm chuẩn (NaOH hay KOH) để trung hòa acid lactic có trong mẫu với phenolphthalein 1% làm chất chỉ thị. (Phụ lục 6)
2.6.10 Xác định hoạt tính enzyme cellulase
Nguyên lý:Dựa vào lượng đường khử sinh ra sau khi enzyme cellulase tác dụng trên cơ chất giàu cellulose (CMC). Hàm lượng đường khử được định lượng theo Miller. (Phụ lục 7)
2.6.11 Xác định hoạt tính enzyme pectinase
Nguyên lý: Cho chế phẩn pectinase tác dụng với cơ chất là pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic hiện màu với thuốc thử DNS và đem đo mật độ quang ở bước sóng 575nm. (Phụ lục 8)
2.6.12 Phương pháp hoạt hóa, tăng sinh và giữ giống.
- Giống vi sinh vật được bảo quản dưới dạng đông khô.
- Pha chế môi trường MRS broth và môi trường MRS - agar.
- Hòa dịch nhũ đông khô vào nước cất vô trùng (0,2 – 0,3ml cho mỗi ống).
HVTH: Nguyễn Thị Việt Hải Trang 36 - Cấy giống vào môi trường MRS - agar trên đĩa Petri, cho vào tủ ấm để phục hồi giống ban đầu.
- Cấy giống vi khuẩn vào môi trường dịch MRS để tăng sinh giống, thu sinh khối tế bào sau 24 - 48 giờ. Cấy chuyền một lần nữa vào môi trường nhân giống sau 24 - 48 giờ ta có thể sử dụng để lên men.
- Khảo sát vi thể và xác định Gram bằng phương pháp nhuộm Gram.
- Kiểm tra số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus phát triển trên môi trường MRS bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc.
2.6.13 Phương pháp đếm khuẩn lạc
Nguyên lý: Cấy một thể tích xác định mẫu huyền phù vi sinh vật lên môi trường thạch trong hộp petri. Sau một thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc và ta có thể quan sát được bằng mắt thường. Dựa vào số khuẩn lạc đếm đƣợc, thể tích mẫu đã lấy và hệ số pha loãng, ta có thể suy ra số tế bào vi sinh vật có trong 1ml mẫu ban đầu. (Phụ lục 9)
2.6.14 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo mật độ quang
Nguyên lý: Mật độ tế bào có thể xác định gián tiếp dựa vào độ đục. Khi một pha lỏng có chứa nhiều cấu tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phân tử hiện diện trong môi trường lỏng cản trở ánh sáng. Tế bào hiện diện trong môi trường lỏng sẽ làm môi trường trở nên đục. Độ đục tỉ lệ với mật độ tế bào.
Do đó có thể định lƣợng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua độ đục bằng máy so màu.
Xây dựng trương quan tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục như sau:
Vi khuẩn L.acidophilus được nuôi trong môi trường dịch dứa với tỉ lệ giống bổ sung là 5%, ở 37oC, trong 24 giờ.
Pha loãng dịch huyền phù chứa vi khuẩn L.acidophilus có mật độ bất kỳ thành các huyền phù khác nhau ở OD570 . Bên cạnh đó đo mẫu đối chứng không chứa vi sinh vật ở OD570 .
HVTH: Nguyễn Thị Việt Hải Trang 37 Dùng phương pháp trải đĩa đếm khuẩn lạc xác định mật độ tế bào ứng với mỗi nồng độ pha loãng.
Tính giá trị log(cfu/ml) cho mỗi giá trị mật độ tương ứng với mỗi độ đục. Vẽ đường tương quan tuyến tính giữa log cfu/ml – trục tung và OD570 – trục hoành. Xác định khoảng tuyến tính giữa trục tung và trục hoành.
Để xác định mật độ tế bào của dịch huyền phù X, ta tiến hành đo mẫu chƣa có vi sinh vật và mẫu đã có vi sinh vật. Dựa vào ∆OD và đường tương quan giữa log(cfu/ml) và OD570, ta suy ra đƣợc mật độ tế bào của mẫu cần đo.
Xác định mật độ tế bào vi khuẩn trong dịch lên men bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 570nm.
2.6.15 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng
Nguyên lý: dựa vào sự phát triển của vi sinh vật vào các thời điểm khác nhau.
Xây dựng đường cong sinh trưởng của L.acidophilus trong môi trường dịch dứa:
- Vi khuẩn được nuôi trong môi trường dịch dứa ở nhiệt độ 37oC trong tủ ấm.
- Cứ sau 2 giờ lấy 2 ml đi xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang.
- Vẽ đồ thị đường cong sinh trưởng giữa log (cfu/ml) – trục tung và thời gian – trục hoành.
2.6.16 Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm đều đƣợc lặp lại 3 lần. Kết quả thí nghiệm trình bày trong luận văn là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Số liệu đƣợc xử lí theo ANOVA bằng phần mềm Statgraphics XV để so sánh sự khác biệt giữa 2 giá trị là có ý nghĩa hay không, dùng phần mềm tối ƣu hóa Mode 5.0 để thiết lập ma trận quy hoạch thực nghiệm, tối ƣu hóa các thông số.