Sau khi chuẩn bị, huyền phù vi khuẩn được chia làm 3 lọ như nhau. Các lọ dung dịch này sẽ được đo giá trị pH theo từng mốc thời gian. Giá trị pH trung bình của huyền phù vi khuẩn theo thời gian được thể hiện qua biểu đồ hình 3.1.
Hình 3.1 Sự thay đổi pH của huyền phù vi khuẩn và dung dịch urea-CaCl2 đối chứng theo thời gian
Từ biểu đồ hình 3.1, ta thấy giai đoạn 5 giờ đầu pH cả hai dung dịch đều giảm.
Tuy nhiên, đến thời gian sau 5 giờ thì pH huyền phù vi khuẩn tăng lên. Trong quá trình tăng pH của huyền phù vi khuẩn, giai đoạn từ sau 5 giờ đến 24 giờ, tốc độ tăng pH nhanh, thể hiện ở độ dốc lớn của đồ thị. Thời gian càng dài, tốc độ tăng pH của huyền phù vi khuẩn càng giảm. Trong khi đó, dung dịch urea-CaCl2 sau khi giảm nhanh trong giai đoạn đầu, hầu như có pH giảm ổn định.
Nguyên nhân của hiện tượng pH huyền phù vi khuẩn giảm rồi lại tăng lên là do trong huyền phù vi khuẩn diễn ra quá trình thủy phân urea, làm gia tăng pH trong môi trường vi mô, dẫn đến sự hình thành CaCO3.
Thực hiện: Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh
Đối với các vi sinh vật ưa kiềm, pH ngoài tế bào cao, nồng độ proton thấp, dẫn đến proton có xu hướng khuếch tán từ trong tế bào theo gradient nồng độ (trong cao/ngoài thấp). Để chống lại quá trình này, vi sinh vật phát triển hai cơ chế để dẫn proton đi ngược vào trong tế bào để tạo ATP.
Các cơ chế này sẽ làm tăng pH trong tế bào. Điều này dẫn đến kiềm tính của tế bào chất tăng lên (giảm sự chênh lệch pH trong màng ngoài tế bào) và tăng điện thế màng thông qua sự thải ra một cation NH4+ ứng với một ATP. Do đó, sự phân bố điện tích xuyên qua màng tế bào tăng lên, động lực proton dẫn đến các proton đi vào tế bào, ngược với gradient nồng độ.
Hiện tượng pH giảm rồi tăng lên trong quá trình tạo caclite là do các diễn biến sinh hóa giữa môi trường bên trong và ngoài tế bào vi khuẩn. Đồng thời, quá trình thay đổi pH này cũng liên quan đến sự hình thành các dạng thù hình khác nhau của CaCO3 là caclite, aragonite và vaterite.
Như vậy, việc tăng pH của huyền phù vi khuẩn cho thấy khá rõ quá trình tạo cacite từ vi khuẩn cũng như chuyển đổi thù hình aragonite thành dạng thù hình bền vững là calcite.
3.1.2. Phổ phân tích nhiễu xạ tia X
Huyền phù vi khuẩn được chuẩn bị và chia ra trong các lọ tương ứng với một mốc thời gian. Sau các mốc thời gian 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64 và 128 giờ, tiến hành lọc huyền phù vi khuẩn thu sinh khối. Sinh khối sau đó được sấy khô, nghiền mịn qua sàng 63àm để tiến hành phõn tớch nhiễu xạ tia X (XRD), xỏc định thành phần khoáng. Chúng tôi cũng tiến hành phân tích XRD với mẫu calcite đối chứng.
Hình 3.2 Sinh khối vi khuẩn
Thực hiện: Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh
Để thuận tiện cho việc đối chiếu các kết quả, chúng tôi thực hiện chồng các phổ XRD của sinh khối vi khuẩn.
Hình 3.3 Kết quả chồng phổ XRD của sinh khối vi khuẩn theo thời gian
Từ kết quả chồng phổ XRD (Hình 3.3), ta có thể nhận thấy mức độ kết tinh tạo calcite trong sinh khối vi khuẩn tăng theo thời gian. Cụ thể, ở các vị trí peak đặc trưng 2 = 29,5; 47,5; 48,5o của calcite. Bên cạnh đó, ta cũng nhận thấy các peak tinh thể sắc nét và có cường độ cao dần theo thời gian. Điều này có thể minh chứng cho mức độ kết tinh ngày càng hoàn thiện của các tinh thể calcite.
Ngoài ra, nếu xét đến sự thay đổi diện tích các peak tinh thể, ta thấy rằng diện tích này tăng theo thời gian. Một cách tương đối, ta có thể xác định mức độ kết tinh trong sinh khối vi khuẩn bằng cách lấy tổng diện tích các peak tinh thể chia cho tổng diện tích toàn phổ [62]. Các tỷ lệ này được đối chiếu với tỷ lệ diện tích trong mẫu chuẩn calcite tinh khiết đối chứng.
Ta có biểu thức thể hiện mối quan hệ giữa độ kết tinh và diện tích peak trên phổ XRD như sau [62]:
0
0 100%
crystal total total crystal
A A
N A A
Thực hiện: Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh
Trong đó:
N: là độ kết tinh (%)
Acrystal, Atotal: là tổng diện tích pha tinh thể (tính từ đường nền lên đến đỉnh peak) và diện tích tổng trong phổ khảo sát.
0 crystal
A , Atotal0 : là tổng diện tích pha tinh thể (tính từ đường nền lên đến đỉnh peak) và diện tích tổng trong phổ chuẩn.
Dựa vào phổ XRD các mẫu theo thời gian, ta tính được độ kết tinh (Hình 3.4).
Hình 3.4 Phần trăm kết tinh dựa vào phổ XRD
Các kết quả tính toán cho thấy mức độ kết tinh trong sinh khối vi khuẩn tăng theo thời gian.
3.1.3. Ảnh quan sát trên kính hiển vi quang học
Phương pháp XRD cho kết quả bán định lượng về mức độ kết tinh của calite.
Do đó, để đánh giá khách quan và có cái nhìn toàn diện hơn, chúng tôi sử dụng thêm một phương pháp đánh giá kết tinh khác là quan sát trực tiếp. Chúng tôi tiến hành khảo sát sự kết tinh calcite thông qua quan sát mẫu vi khuẩn trên đĩa petri bằng kính hiển vi quang học soi ngược theo các mốc thời gian. Từ các kết quả quan sát ở độ phóng đại 100x, mức độ kết tinh được tính toán dựa trên diện tích tinh thể trên nền diện tích chung.
Thực hiện: Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh
Hình 3.5 Ảnh kính hiển vi quang học soi ngược sinh khối vi khuẩn theo thời gian Từ các kết quả tính toán, khi so sánh với kết quả thu được bằng phương pháp XRD, ta nhận thấy có sự tương đồng nhất định về xu hướng kết tinh calcite từ vi khuẩn Bacillus subtilis HU58. Tuy nhiên, để có cái nhìn chính xác hơn về quá trình này, cần bố trí nhiều thí nghiệm theo hướng khảo sát động học kết tinh calcite từ vi khuẩn trong cả môi trường tự do của phòng thí nghiệm và trong môi trường bê-tông xi-măng, kèm theo các đánh giá các yếu tố ảnh hưởng của môi trường.
Trên biểu đồ hình 3.6, từ các số liệu tính toán, thực hiện đường cong nội suy theo hàm logarit, ta được kết quả tương đồng của hai phương pháp tính toán, cả về giá trị và độ dốc trong từng giai đoạn.
Thực hiện: Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh
Hình 3.6 Phần trăm kết tinh tính toán theo phương pháp XRD (a) và kính hiển vi quang học soi ngược (b)
Các nghiên cứu trước đây chỉ dừng lại ở việc khảo sát động học kết tinh của CaCO3 trong môi trường dung dịch, việc khảo sát trong môi trường bê-tông theo cơ chế sinh học vi khuẩn sẽ mở ra cái nhìn rõ ràng hơn cho mảng đề tài này.
3.1.4. Phổ phân tích hồng ngoại
Đồng thời với phân tích XRD và quan sát trên kính hiển vi quang học soi ngược, chúng tôi cũng tiến hành phân tích phổ hồng ngoại (FTIR) đối với các mẫu sinh khối vi khuẩn và mẫu calcite đối chứng nhằm đánh giá khả năng tạo calcite. Các kết quả phân tích FTIR của sinh khối vi khuẩn theo thời gian được trình bày trong hình 3.7.
Trên phổ FTIR, tại vị trí 712, 874, 1459, 2519cm-1 là các peak đặc trưng các liên kết trong CaCO3. Ta cũng nhận thấy ở các peak 1798, 2880, 2980cm-1 phù hợp với liên kết C=O trong CO32-. Ta thấy diện tích peak ở 2880 và 2980 tăng dần theo thời gian, tương ứng với mức kết tinh càng tăng. Vùng peak mạnh ở 1469cm-1 là liên kết C-O, Các peak đặc trưng của liên kết trong calcite thể hiện sự sắc nét theo thời gian (Hình 3.7). Điều này có thể chứng tỏ quá trình kết tinh calcite ngày một tốt hơn theo thời gian.
Các kết quả phân tích FTIR phù hợp với các kết quả XRD cũng như quan sát từ kính hiển vi quang học đã phân tích ở trên.
Thực hiện: Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh
Hình 3.7 Kết quả chồng phổ FTIR sinh khối vi khuẩn theo thời gian 3.1.5. Phân tích ảnh hình thái tinh thể
Sau khi xác định được sự hiện diện của các tinh thể calcite trong sinh khối vi khuẩn, phần nào chứng minh được vi khuẩn có khả năng tạo ra calcite, chúng tôi tiến hành phân tích hình thái tinh thể calcite này. Các kết quả phân tích hình ảnh qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của mẫu sinh khối vi khuẩn chứa các tinh thể calcite thu được như sau.
Hình 3.8 Ảnh TEM sinh khối vi khuẩn sau 128 giờ
Từ kết quả hình ảnh TEM (Hình 3.8), ta thấy các tinh thể calcite hình thành bao quanh vi khuẩn tạo thành cụm tinh thể dạng que. Điều này phù hợp với giả thuyết ban
Thực hiện: Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh
đầu là các tinh thể calcite bao bọc vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 tạo ra một dạng cốt liệu calcite hình que, cốt liệu dạng này sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện cường độ chịu nén và chịu uốn của mẫu vữa sau này.
Như vậy, từ các kết quả phân tích thành phần khoáng XRD, kết quả phân tích liên kết bằng phổ FTIR và kết quả quan sát hình thái tinh thể TEM, ta có thể nhận định rằng vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 có khả năng tạo ra các tinh thể calcite, bao bọc lấy tế bào vi khuẩn tạo thành khối tinh thể hình que. Quá trình tạo tinh thể calcite tăng theo thời gian.