Để biết được liệu vi khuẩn có được bảo vệ và tồn tại bên trong các lỗ rỗng của diatomite như giả thuyết ban đầu hay không, chúng tôi tiến hành chụp SEM bên trong các viên diatomite cố định vi khuẩn. Kết quả chụp SEM thu được như sau.
Hình 3.14 Ảnh SEM vi khuẩn sống bên trong các lỗ rỗng của diatomite
Thực hiện: Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh
Qua ảnh SEM (Hình 3.14) với độ phóng đại cao (10000 lần), ta có thể thấy những vật thể dạng hình que trong các lỗ rỗng của diatomite. Các vật thể hình que này có hình thái tương đối giống hình thái của vi sinh vật. Chúng tôi tiến hành đối chiếu với ảnh SEM và ảnh TEM chụp vi khuẩn Bacillus subtilis mà các nhà khoa học đã nghiên cứu trước đây.
(a) (b)
Hình 3.15 Ảnh SEM Bacillus subtilis 168 theo nghiên cứu của J.C. Zweers [63] (a) và ảnh TEM Bacillus subtilis của Robert Harris (b)
Từ hình ảnh đối chiếu về hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis do các nhà khoa học chụp trước đây, có thể thấy sự tương đồng nhất định giữa vật thể mà chúng tôi nghi ngờ và vi khuẩn Bacillus subtilis.
Một lần nữa, phân tích EDX được chúng tôi sử dụng để phân tích thành phần nguyên tố tại các vị trí hình que nghi ngờ là vi sinh vật trên ảnh SEM.
Hình 3.16 Phổ EDX tại các vị trí hình que nghi ngờ vi khuẩn trên ảnh SEM Kết quả EDX (Hình 3.16) mà chúng tôi thu được cho thấy sự tồn tại của các nguyên tố C, Ca, O, K, Fe, Al, Si, Sn. Các nguyên tố này tương đối trùng khớp với các nguyên tố có trong màng tế bào vi khuẩn. Từ đây, càng có thêm cơ sở để nhận
Thực hiện: Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh
định những vị trí dạng hình que này là vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 mà chúng tôi cố định ban đầu trong diatomite.
3.3.2. Ảnh chụp quan sát qua kính hiển vi quang học
Từ các kết quả quan sát trên ảnh SEM và phân tích nguyên tố EDX, phần nào sự tồn tại của vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 trong các lỗ rỗng của diatomite đã được chứng minh. Chúng tôi tiến hành phân tích sự sống của vật thể nghi ngờ vi khuẩn này. Chúng tôi tách lấy một phần bề mặt bột của viên diatomite cố định vi khuẩn để thực hiện nuôi tạo khuẩn lạc. Phần bột này được pha loãng với nước cất, sau đó bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn phát triển và tiến hành nuôi trên đĩa petri trong môi trường vô trùng với nhiệt độ và độ ẩm ổn định.
Sau 7 ngày, quan sát đĩa petri (Hình 3.17a), có thể nhận thấy sự phát triển của vi khuẩn thông qua sự xuất hiện khuẩn lạc. Hình dạng của khuẩn lạc được ghi nhận và đối chiếu với hình dạng khuẩn lạc của Bacillus subtilis mà các nhà khoa học đã thực hiện trước đây.
(a) (b)
Hình 3.17 Khuẩn lạc nuôi trên đĩa petri (a) và khuẩn lạc chuẩn đối chứng của Bacillus subtilis sau 48h ở 37oC, chụp bởi A.W. Rakosy/EB Inc (b)
Với khả năng tạo khuẩn lạc, ta có thể kết luận có tồn tại vi khuẩn và vi khuẩn vẫn sống bên trong viên diatomite. Kết hợp với sự tương đồng rõ rệt về hình dạng khuẩn lạc [64], có thể nhận định vi khuẩn sống này là Bacillus subtilis HU58 mà chúng tôi đã cố định ban đầu.
3.3.3. Phân tích định danh vi khuẩn
Các viên nén diatomite cố định vi khuẩn sau mốc thời gian 5 tháng được bẻ đôi, lấy phồi lõi bên trong thực hiện phân tích định danh vi khuẩn xem Bacillus subtilis
Thực hiện: Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh
HU58 ban đầu có còn sống hay không. Mẫu được nuôi tạo khuẩn lạc trong thiết bị Memmert typ INE600, sau đó thực hiện phân tích tìm ra loài rồi dùng máy đếm (theo National Public Health Service For Wales – NHS F15:2005) có quang phổ với bước sóng hấp thụ protein để tính mật độ. Các phân tích được thực hiện tại Công ty TNHH Eurofins Sắc Ký Hải Đăng (phụ lục hình 12, 13).
Hình 3.18 Vi khuẩn được định danh lấy từ các viên diatomite để trong môi trường không khí sau 5 tháng
Kết quả phân tích theo tiêu chuẩn Anh cho vi sinh vật (UK Standards for Microbiology Investigations – SMIs) cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 còn sống và hoạt động, với mật độ 2,7x108CFU/g.
Cùng phương pháp thí nghiệm như trên, nhóm mẫu viên nén thứ hai được trộn trong phối liệu bê-tông. Các mẫu bê-tông kích thước 150x150x150mm được bảo dưỡng ẩm trong 60 ngày, sau đó phá hủy mẫu để lấy các viên nén chứa vi khuẩn ra phân tích (Hình 3.19).
Hình 3.19 Vi khuẩn lấy từ viên diatomite trong mẫu bê-tông để phân tích định danh
Thực hiện: Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh
Kết quả định danh và xác định mật độ cho thấy Bacillus subtilis HU58 còn sống với mật độ 6,9x107CFU/g.
Thực hiện thí nghiệm trên với mẫu bê-tông chứa vi khuẩn không được bảo vệ trong viên nén, tức là mẫu vi khuẩn tự do. Kết quả sau 60 ngày không còn phát hiện vi khuẩn Bacillus subtilis HU58.
Như vậy, với các kết quả trên, có thể thấy hiệu quả bảo vệ của diatomite đối với sự tồn tại của vi khuẩn. Vi khuẩn không được bảo vệ không có khả năng tồn tại cao trong môi trường bê-tông với thời gian dài. Nhưng khi được cố định trong diatomite, khả năng sống của vi khuẩn được duy trì đáng kể. Trong môi trường bê-tông, do phải chịu ứng suất cơ và nhiệt thủy hóa của các khoáng xi-măng, mật độ vi khuẩn thấp hơn so với trong viên nén ở điều kiện tự do.