NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

Chế phẩm enzyme

Các chế phẩm amylase dùng trong nghiên cứu này là chế phẩm thương mại do hãng Novozymes (Đan Mạch) sản xuất và được cung cấp bởi Công ty trách nhiệm hữu hạn Brenntag Việt Nam thuộc tập đoàn Brenntag (Đức), địa chỉ: 202 Hoàng Văn Thụ, phường 09, quận Phú Nhuận thành phố Hồ Chí Minh.

Chế phẩm enzyme α – amylase có tên thương mại là Termamyl 120L. Đây là chế phẩm chứa α – amylase bền nhiệt có xuất xứ từ canh trường vi khuẩn Bacillus licheniformis. Điều kiện hoạt động thích hợp của chế phẩm là 85oC – 95oC, pH 6,0 – 7,0. Chế phẩm có hoạt độ 120 KNU/g (Kilo Novo Unit). Một KNU được hãng Novozymes định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để xúc tác thủy phân 5,26 g tinh bột hòa tan trong một giờ trong điều kiện pH 5,6 và nhiệt độ 37oC theo phương pháp chuẩn của Novozyme (Termamyl® 120 L, Type L Product Data Sheet, Novo Nordisk, 2005).

Chế phẩm enzyme glucoamylase có tên thương mại là Dextrozyme GA. Đây là chế phẩm chứa glucoamylase có xuất xứ từ canh trường nấm mốc Aspergillus niger.

Điều kiện hoạt động thích hợp của chế phẩm là 60oC – 65oC, pH 4,0 – 5,0. Chế phẩm có hoạt độ 270 AGU/g (AmyloGlucosidase Unit). Một AGU được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để xúc tác thủy phân ra 1 μmol đường glucose trong 1 phút ở điều kiện nồng độ cơ chất 10 mg/mL; nhiệt độ 37oC; pH 5,0; thời gian phản ứng 30 phút (Dextrozyme® GA Product Data Sheet, Novo Nordisk, 2005).

Tinh bột khoai mì

Tinh bột khoai mì được tài trợ bởi Công Ty Ajinomoto Việt Nam. Tinh bột có độ ẩm 13 ± 0,5%. Hàm lượng tinh bột 86 ± 0,5%. Kích thước trung bình của hạt tinh bột khoai mì là 41μm. Nhiệt độ bắt đầu hồ hóa và nhiệt độ đạt đỉnh nhớt của dung dịch tinh bột 5% tương ứng là 65oC và 75oC.

- 29 - Các hóa chất phân tích

Các hóa chất phân tích gồm tinh bột hòa tan, maltodextrin DE 20, thuốc thử DNA 3,5 – dinitrosalicylic acid, thuốc thử Coomassie Brilliant Blue, hệ đệm natri phosphate và hệ đệm citrate phosphate do hãng Merck (Đức) sản xuất.

Nội dung nghiên cứ u

Khi sóng siêu âm tác động vào hỗn hợp nước, tinh bột và enzyme, hiện tượng xâm thực có thể tác động đến cấu trúc của hạt tinh bột và hoạt độ của enzyme. Để có thể hiểu rõ ảnh hưởng của sóng siêu âm đến từng nhóm cấu tử của hỗn hợp, luận án được chia thành 4 phần: Xử lý siêu âm huyền phù tinh bột khoai mì; Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase; Xử lý siêu âm hỗn hợp huyền phù tinh bột khoai mì có chứa enzyme và so sánh hiệu quả của các giải pháp làm tăng hiệu quả thủy phân.

Phần 1: Xử lý siêu âm huyền phù tinh bột khoai mì – Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn hồ hóa: Mục đích của phần này nhằm tìm hiểu quy luật ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình giải phóng amylose và amylopectin ra khỏi hạt tinh bột, làm tăng độ hòa tan tinh bột khi không có enzyme xúc tác.

Phần 2: Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase nhằm tìm hiểu quy luật ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ và tính chất của hai chế phẩm Termamyl 120L và Dextrozyme GA khi không có mặt tinh bột

Phần 2.1. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm Termamyl 120L

 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ α- amylase của chế phẩm Termamyl 120L:

Xác đi ̣nh quy luật ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt tính xúc tác bằng phương pháp cổ điển và quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m.

 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tính chất của chế phẩm Termamyl 120L: Xác định và so sánh tính chất của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng; trong đó, chế phẩm Termamyl 120L có hoạt độ gia tăng nhờ xử lý siêu âm được gọi tắt là mẫu siêu âm, và chế phẩm Termamyl 120L ban đầu được gọi tắt là mẫu đối chứng. Nội dung khảo sát bao gồm: biến đổi hoạt độ α – amylase theo pH và nhiệt độ; các thông số động học và nhiệt động học của phản ứng thủy phân tinh bột hòa tan có enzyme xúc tác và các thông số nhiệt động của quá trình vô hoạt enzyme.

- 30 -

Phần 2.2: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm enzyme Dextrozyme GA

 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ glucoamylase của chế phẩm Dextrozyme GA: Xác đi ̣nh quy luật ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt tính xúc tác bằng phương pháp cổ điển và quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m.

 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tính chất của chế phẩm Dextrozyme GA: Xác định và so sánh tính chất của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng; trong đó, chế phẩm Dextrozyme GA có hoạt độ gia tăng nhờ xử lý siêu âm được gọi tắt là mẫu siêu âm, và chế phẩm Dextrozyme GA ban đầu được gọi tắt là mẫu đối chứng. Nội dung khảo sát bao gồm: biến đổi hoạt độ glucoamylase theo pH và nhiệt độ.

Phần 3: Xử lý siêu âm hỗn hợp huyền phù tinh bột khoai mì có chứa enzyme – Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn dịch hóa: Mục đích của phần này nhằm xác đi ̣nh quy luật ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình giải phóng và thủy phân tinh bột, làm tăng hàm lượng tinh bột hòa tan trong hỗn hợp tinh bột và enzyme.

Phần 4: So sánh các giải pháp sử dụng sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả thủy phân tinh bột khoai mì: sử dụng enzyme có hoạt độ gia tăng nhờ xử lý siêu âm để xúc tác cho quá trình thủy phân và sử dụng sóng siêu âm để xử lý hỗn hợp huyền phù tinh bột khoai mì và enzyme trong giai đoạn dịch hóa. Thông số so sánh là hiệu suất thủy phân tinh bột sau hai giai đoạn dịch hóa và đường hóa; lượng enzyme sử dụng và năng lượng siêu âm cần sử dụng để tăng thêm 1g đường khử so với mẫu đối chứng.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiê ̣m Phương pháp cổ điển

Chúng tôi thay đổi giá tri ̣ một thông số cần khảo sát, cố đi ̣nh giá tri ̣ các thông số

còn la ̣i, từ đó xác định quy luật biến đổi của hàm mu ̣c tiêu theo thông số khảo sát.

Phương pháp quy hoạch thực nghiê ̣m

Chúng tôi thay đổi đồng thời các thông số cần khảo sát theo ma trâ ̣n quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m phương án quay bậc hai có tâm của Box – Hunter nhằm đánh giá ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố đến hàm mu ̣c tiêu và xác đi ̣nh giá tri ̣ của các yếu tố để hàm mu ̣c tiêu đa ̣t giá tri ̣ cực đa ̣i.

- 31 - Bố trí thí nghiệm

Phần 1: Xử lý siêu âm huyền phù tinh bột khoai mì – Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn hồ hóa

 Mu ̣c đích: xác đi ̣nh quy luật ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột trong huyền phù ban đầu và các thông số nhiệt độ, công suất, thời gian siêu âm đến độ hòa tan tinh bột trong giai đoạn hồ hóa.

 Cách thực hiện: Dựa vào các kết quả tham khảo trong phần tổng quan (Bảng 1.4) và các kết quả thí nghiệm sơ bộ, các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn hồ hóa được tiến hành như sau: 100 gram tinh bột khoai mì được hòa với nước cất với các thể tích khác nhau. Hỗn hợp huyền phù được gia nhiệt trong thiết bị phản ứng đến một giá trị nhiệt độ xác định. Các “mẫu siêu âm” được xử lý với thời gian và công suất siêu âm được cài đặt sẵn. Quá trình siêu âm được thực hiện trong thiết bị phản ứng có hệ thống điều nhiệt sao cho nhiệt độ các mẫu xử lý không vượt quá giá trị nhiệt độ cần khảo sát. Các “mẫu đối chứng” được ủ trong thiết bị phản ứng ở nhiệt độ tương đương với các “mẫu siêu âm”. Sau đó, cả mẫu siêu âm và đối chứng đều được gia nhiệt lên đến 90oC và ủ ở nhiệt độ này sao cho tổng thời gian hồ hóa (gồm thời gian xử lý nhiệt và siêu âm) là 60 phút. Mẫu phân tích được lấy ở thời điểm bắt đầu siêu âm, kết thúc siêu âm và sau mỗi 10 phút trong suốt quá trình thí nghiệm để xác định hàm lượng tinh bột hòa tan, từ đó xác định phương trình động học mô tả độ hòa tan tinh bột theo thời gian hồ hóa. Bên cạnh đó, để giải thích ảnh hưởng của nhiệt độ bắt đầu siêu âm đến độ hòa tan tinh bột trong các thí nghiệm 1.2 (Bảng 2.1), tiến hành xác định sự biến thiên độ nhớt của huyền phù tinh bột khoai mì theo sự gia tăng nhiệt độ trong giai đoạn hồ hóa.

 Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm sẽ được bố trí theo phương pháp cổ điển. Các yếu tố cố định và thay đổi được trình bày trong Bảng 2.1.

 Kết quả dự kiến: xác đi ̣nh được quy luâ ̣t ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến độ hòa tan tinh bột sau 60 phút hồ hóa và tại thời điểm cân bằng.

- 32 -

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiê ̣m khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình xử lý siêu âm đến hàm lượng tinh bột hòa tan trong giai đoạn hồ hóa

TN1 Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định

1.1 Hàm lượng huyền phù tinh bột (%) 5 – 10 – 15 – 20 – 25 – 30 – 35%

- Nhiệt độ bắt đầu siêu âm: 65oC - Công suất siêu âm: 3W/g tinh bột - Thời gian siêu âm: 10 phút 1.2 Nhiệt độ bắt đầu siêu âm (oC)

50 – 60 – 64 – 65 – 70 – 75 – 77

- Nồng độ huyền phù tinh bột: được chọn từ kết quả TN1.1 - Công suất siêu âm: 3W/g tinh bột

- Thời gian siêu âm: 10 phút 1.3 Công suất siêu âm (W/g tinh bột)

0 – 1,5 – 2,25 – 3,0 – 3,75 – 4,5

- Nồng độ huyền phù tinh bột: được chọn từ kết quả TN1.1 - Nhiệt độ bắt đầu siêu âm: được chọn từ kết quả TN1.2 - Thời gian siêu âm: 10 phút

1.4 Thời gian siêu âm (phút) 0 – 5 – 10 – 15 – 20 – 25

- Nồng độ huyền phù tinh bột: được chọn từ kết quả TN1.1 - Nhiệt độ bắt đầu siêu âm: được chọn từ kết quả TN1.2 - Công suất siêu âm được: chọn từ kết quả TN1.3

Phần 2: Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase

Dựa vào các kết quả tham khảo trong phần tổng quan (Mục 1.4.1.2) và các kết quả thí nghiệm sơ bộ, các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính và tính chất chế phẩm enzyme amylase được tiến hành như sau:

2.4.2.1 Phần 2.1. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm Termamyl 120L

a. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ α- amylase của chế phẩm Termamyl 120L

 Mu ̣c đích: xác đi ̣nh quy luật biến đổi hoạt độ α - amylase của chế phẩm Termamyl 120L khi thay đổi các thông số nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm.

 Cách thực hiện: 15 mL chế phẩm enzyme được cho vào cốc thủy tinh để xử lý siêu âm với thời gian và công suất được cài đặt sẵn. Trong quá trình siêu âm, cốc đựng mẫu được đặt trong bể nước lạnh để điều nhiệt sao cho nhiệt độ mẫu không vượt quá giá trị nhiệt độ cần khảo sát. Sau quá trình siêu âm, các mẫu enzyme được đem xác định hoạt độ amylase và so sánh hoạt độ với các mẫu đối chứng. Các “mẫu đối chứng” được ủ trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ và thời gian tương đương với các “mẫu siêu âm”. được không xử lý siêu âm. Để giải thích nguyên nhân sóng siêu âm làm thay đổi hoạt tính amylase trong mẫu siêu âm, mẫu enzyme siêu âm có hoạt độ α – amylase tăng cao nhất và mẫu enzyme đối chứng được đem đi xác định hàm lượng protein hòa tan, thành phần protein theo phân tử lượng, phổ UV, phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

- 33 -

 Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp cổ điển và quy hoạch thực nghiệm quay bậc hai có tâm của Box – Hunter. Các thông yếu tố cố định và thay đổi được trình bày trong Bảng 2.2.

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiê ̣m theo phương pháp cổ điển về ảnh hưởng của các yếu tố xử lý siêu âm đến hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme thương mại

TN2.1 Yếu tố thay đổi Yếu tố cố định

2.1.1 Nhiệt độ siêu âm (oC) 20 – 30 – 40 – 50 – 60

- Công suất siêu âm: 20W/mL chế phẩm - Thời gian siêu âm: 60 giây

2.1.2 Công suất siêu âm (W/mL chế phẩm) 0 – 10 – 15 – 20 – 25 – 30 – 35

- Nhiệt độ siêu âm: được chọn từ kết quả TN2.1.1 - Thời gian siêu âm: 60 giây

2.1.3

Thời gian siêu âm (giây) 0 – 30 – 45 – 60 – 75 – 90 – 105 – 120 –

135 – 150

- Nhiệt độ siêu âm: được chọn từ kết quả TN2.1.1 - Công suất siêu âm: được chọn từ kết quả TN2.1.2

 Kết quả dự kiến: xác đi ̣nh được quy luâ ̣t ảnh hưởng của các yếu tố xử lý siêu âm đến hoạt độ amylase của chế phẩm Termamyl 120L; chọn được các yếu tố xử lý siêu âm để hoạt độ amylase của chế phẩm Termamyl 120L đạt giá trị cao nhất.

b. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tính chất của chế phẩm Termamyl 120L

Sử dụng các yếu tố xử lý siêu âm đã tìm được ở mục 2.4.2.1.a để làm tăng hoạt tính xúc tác của chế phẩm Termamyl 120L. Chế phẩm này được gọi tắt là enzyme siêu âm. Trong các thí nghiệm tiếp theo, tính chất của chế phẩm enzyme siêu âm sẽ được so sánh với chế phẩm “enzyme đối chứng” (không qua siêu âm).

i. pH tối ưu và các thông số động học enzyme

 Mu ̣c đích: xác đi ̣nh và so sánh ảnh hưởng của pH đến hoạt độ amylase của hai chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng

 Cách thực hiện: Mỗi mẫu thí nghiệm được đem đi xác định hoạt độ amylase và các thông số động học (vmax, Km, kcat, kcat/Km) khi thay đổi giá trị pH từ 5,0 đến 9,0, nhiệt độ được ổn định ở 85oC. Giá trị hoạt độ enzyme thu được ở các điều kiện pH khác nhau sẽ được tính theo tỷ lệ phần trăm so với điều kiện pH cho hoạt độ cao nhất.

 Kết quả dự kiến: xác đi ̣nh được quy luật ảnh hưởng của pH đến hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng và giá trị pH tối thích của chế phẩm enzyme siêu âm và enzyme đối chứng.

ii. Nhiệt độ tối ưu, các thông số động học enzyme và nhiệt động học phản ứng

 Mu ̣c đích: xác đi ̣nh và so sánh ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ amylase của hai chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng

- 34 -

 Cách thực hiện: Mẫu enzyme siêu âm và enzyme đối chứng được đem đi xác định hoạt độ amylase và các thông số động học (vmax, Km, kcat, kcat/Km) khi nhiệt độ thay đổi từ 50oC đến 95oC, giá trị pH tối ưu được chọn từ thí nghiệm trước. Giá trị hoạt độ enzyme thu được ở các điều kiện nhiệt độ phản ứng khác nhau sẽ được tính theo tỷ lệ phần trăm so với điều kiện nhiệt độ cho hoạt độ cao nhất.

Các thông số nhiệt động của phản ứng thủy phân tinh bột hòa tan do enzyme xúc tác sẽ được tính toán dựa vào các giá trị động học theo nhiệt độ phản ứng. Các thông số nhiệt động gồm có năng lượng hoạt hóa (Ea), enthalpy (ΔH), entropy (ΔS), năng lượng tự do của phản ứng thủy phân tinh bột (ΔG), năng lượng tự do của giai đoạn hình thành phức chất giữa enzyme với cơ chất (ΔGE-S) và năng lượng tự do của giai đoạn chuyển hóa phức enzyme với cơ chất thành phức enzyme với sản phẩm (ΔGE- T).

 Kết quả dự kiến: Xác đi ̣nh được quy luật ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng; giá trị pH và nhiệt độ tối thích của chế phẩm enzyme siêu âm và enzyme đối chứng; xác định được các thông số động học và nhiệt động học của phản ứng thủy phân tinh bột hòa tan được xúc tác bởi chế phẩm enzyme siêu âm và enzyme đối chứng.

iii. Độ bền hoạt tính của chế phẩm Termamyl 120L

 Mu ̣c đích: xác đi ̣nh và so sánh ảnh hưởng của thời gian (phản ứng hay bảo quản) đến hoạt độ α – amylase trong hai chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng ở các nhiệt độ khác nhau.

 Cách thực hiện:

- Nhiệt độ phản ứng: Chế phẩm enzyme (không có mặt cơ chất) được ủ trong một giờ ở các giá trị nhiệt độ khác nhau gồm 70oC, 75oC, 80oC, 85oC, 90oC. Trong thời gian ủ, tiến hành lấy mẫu sau mỗi 10 phút để xác định hoạt độ α – amylase.

- Nhiệt độ bảo quản: Thí nghiệm được thực hiện tương tự như trên với hai giá trị nhiệt độ khảo sát là 30oC và 5oC. Thời gian khảo sát là 63 ngày, tiến hành lấy mẫu sau mỗi 7 ngày để xác định hoạt độ α – amylase.

- Từ các kết quả thu được, các thông số động học (kin và t1/2)và các thông số nhiệt động học (bao gồm năng lượng hoạt hóa (Ea-in), enthalpy (ΔHin), entropy (ΔSin),

- 35 -

năng lượng tự do (ΔGin)) của quá trình vô hoạt enzyme được xác định theo phương pháp của Eyring và Stearn (1939) [137].

 Kết quả dự kiến: xác đi ̣nh được hằng số tốc độ vô hoạt enzyme, thời gian “bán hủy”

và các thông số nhiệt động học quá trình vô hoạt amylase của mẫu enzyme siêu âm và enzyme đối chứng ở các nhiệt độ khác nhau.

2.4.2.2 Phần 2.2: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm Dextrozyme GA

a. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ glucoamylase của chế phẩm Dextrozyme GA

Thí nghiệm được thực hiện tương tự phần 2.4.2 (mục 2.4.2.1) với thông số cần xác định là hoạt độ glucoamylase. Chế phẩm Dextrozyme GA là một tổ hợp của nhiều enzyme glucoamylase nên luận án này không thực hiện các thí nghiệm xác định phổ UV, phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

b. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tính chất của chế phẩm Dextrozyme GA Các yếu tố xử lý siêu âm đã tìm được ở mục 2.4.2.2.a sẽ được sử dụng để làm tăng hoạt tính xúc tác của chế phẩm Dextrozyme GA. Chế phẩm này được gọi tắt là enzyme siêu âm. Trong các thí nghiệm tiếp theo, tính chất của chế phẩm enzyme siêu âm sẽ được so sánh với chế phẩm “enzyme đối chứng” (không qua siêu âm).

 Mu ̣c đích: xác đi ̣nh và so sánh ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ amylase của hai chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng

 Cách thực hiện: Mỗi mẫu thí nghiệm được đem đi xác định hoạt độ glucoamylase khi giá trị pH thay đổi từ 3,5 đến 5,5, nhiệt độ được ổn định ở 65oC. Giá trị hoạt độ enzyme thu được ở các điều kiện pH khác nhau sẽ được tính theo tỷ lệ phần trăm so với điều kiện pH cho hoạt độ cao nhất. Tiếp theo, enzyme siêu âm và enzyme đối chứng được đem đi xác định hoạt độ amylase khi nhiệt độ thay đổi từ 55oC đến 75oC, pH được giữ ổn định ở giá trị tối ưu xác định được từ thí nghiệm trước. Giá trị hoạt độ enzyme thu được ở các điều kiện nhiệt độ phản ứng khác nhau sẽ được tính theo tỷ lệ phần trăm so với điều kiện nhiệt độ cho hoạt độ cao nhất.

 Kết quả dự kiến: xác đi ̣nh được quy luật ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng và giá trị pH và nhiệt độ tối thích của chế phẩm enzyme siêu âm và enzyme đối chứng.