Phần 2.1: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm enzyme Termamyl 120L
3.2.1.1 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ α- amylase trong chế phẩm Termamyl 120L
a. Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hoạt độ α- amylase trong chế phẩm Termamyl 120L
Khi thay đổi nhiệt độ siêu âm, sự thay đổi hoạt độ α – amylase của chế phẩm Termamyl 120L được trình bày trong Hình 3.10.
Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm Termamyl 120L
Công suất và thời gian siêu âm lần lượt là 20W/mL và 60 giây.
Hoạt độ α – amylase của chế phẩm Termamyl 120L khi chưa siêu âm và được bảo quản ở nhiệt độ 30oC là 103 ± 0,3KU/mL. Hoạt độ của chế phẩm sẽ tăng lên khi tăng nhiệt độ siêu âm từ 20oC đến 45oC. Nhiệt độ siêu âm là 50oC, hoạt độ α – amylase của
- 58 -
chế phẩm không đổi. Hoạt độ α – amylase sẽ giảm đi khi nhiệt độ siêu âm là 60oC. Hoạt độ α – amylase tăng cao nhất khi nhiệt độ siêu âm là 30oC và tăng cao hơn 33,5% so với giá trị hoạt độ ban đầu (Hình 3.10). Trong các thí nghiệm tiếp theo, nhiệt độ siêu âm sẽ được giữ ổn định ở 30oC.
Chúng tôi cho rằng hiện tượng xâm thực do sóng siêu âm sinh ra có thể làm thay đổi cấu hình không gian và hoạt tính xúc tác của enzyme. Hiện tượng xâm thực sẽ làm thay đổi áp suất vi môi trường và làm xuất hiện ứng suất cắt, từ đó có thể phá vỡ các liên kết hydro trong cấu hình không gian của phân tử protein enzyme [149], [150]. Nếu cấu hình không gian của enzyme thay đổi theo chiều hướng giúp cho tâm hoạt động của nó và tinh bột hòa tan dễ tạo phức E – S thì sẽ làm tăng hoạt độ của chế phẩm amylase.
Tuy nhiên, sự gia tăng nhiệt độ siêu âm sẽ làm hiện tượng xâm thực xảy ra mạnh hơn, từ đó có thể phá vỡ liên kết giữa hydro và oxy trong phân tử nước, tạo thành các gốc tự do hydrogen và hydroxyl (H và OH). Các gốc tự do này có thể tham gia phản ứng với các acid amin của enzyme. Nếu các acid amin thuộc tâm hoạt động bị oxy hóa thì làm giảm hoạt tính enzyme. Proline, leucine, isoleucine, lysine và acid glutamic dễ dàng hình thành các peroxide với các gốc hydroxyl tự do OH. Các gốc OH này cũng có thể kết hợp với nhau để tạo thành peroxide là chất ức chế hiệu quả enzyme ngay cả ở nồng độ rất thấp và nhiệt độ phòng [151], [152], [153], [154].
Souza và cộng sự (2013) khi nghiên cứu ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hiệu suất thủy phân tinh bột bởi chế phẩm STARGEN™ 002 (chế phẩm này được thu nhận từ nấm sợi T. reesei và có hoạt tính α - amylase) cũng đưa ra các kết luận tương tự với kết quả của luận án. Khi nhiệt độ siêu âm nhỏ hơn 50oC, hoạt độ α – amylase tăng; khi nhiệt độ siêu âm bằng 50oC, hoạt độ α – amylase không đổi và khi nhiệt độ siêu âm cao hơn 60oC, hoạt độ α – amylase giảm thấp hơn so với mẫu đối chứng [107].
b. Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt độ α- amylase trong chế phẩm Termamyl 120L
Khi thay đổi công suất siêu âm từ 10 đến 30 W/mL, hoạt độ α – amylase của chế phẩm Termamyl 120L là tương đương hoặc tăng cao hơn so với chế phẩm không qua xử lý siêu âm. Khi công suất siêu âm là 35W/mL, hoạt độ enzyme giảm đi (Hình 3.11).
Với công suất siêu âm là 25 W/mL, Termamyl 120L tăng hoạt độ nhiều nhất, cao hơn
- 59 -
35,9% so với mẫu đối chứng. Công suất siêu âm 25 W/mL sẽ được chọn cho thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.11 Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm Termamyl 120L
Nhiệt độ và thời gian siêu âm lần lượt là 30oC và 60 giây.
Công suất siêu âm càng cao thì hiện tượng xâm thực càng mạnh, tần suất tạo ra các
“vi dòng” và “vi tia” càng nhiều, cấu trúc enzyme sẽ bị tác động nhiều hơn từ đó hoạt độ xúc tác sẽ thay đổi nhiều hơn [155]. Đến nay, chưa có các công bố về ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính chế phẩm amylase trong điều kiện không có cơ chất. Tuy nhiên, một số tác giả khác khi tiến hành xử lý siêu âm các chế phẩm cellulase và dextranase trong điều kiện không có cơ chất cũng thu được kết quả tương tự. Wang và cộng sự (2012) nhận thấy rằng khi tăng công suất siêu âm từ 0 đến 15W thì hoạt tính chế phẩm cellulase sẽ tăng lên và đạt cực đại, tuy nhiên, khi tăng công suất từ 15W đến 40W thì hoạt độ enzyme giảm đi [150]. Nghiên cứu của Bashari và cộng sự (2013) về ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm dextranase cho thấy hoạt tính dextranase đạt cực đại khi công suất siêu âm là 40W. Khi công suất siêu âm tăng cao hơn thì hoạt tính enzyme giảm xuống [149].
c. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt độ α- amylase trong chế phẩm Termamyl 120L
Khi tăng thời gian siêu âm từ 30 giây đến 75 giây thì hoạt độ α – amylase sẽ tăng dần đến giá trị cực đại. Nếu kéo dài thời gian siêu âm hơn 75 giây thì hoạt độ enzyme giảm dần. Đặc biệt là các mẫu với thời gian siêu âm 135 và 150 giây đều có giá trị hoạt
- 60 -
độ α – amylase thấp hơn mẫu đối chứng (Hình 3.12). Khi thời gian siêu âm là 75 giây, hoạt độ enzyme tăng cao nhất, tăng 47,2% so với mẫu đối chứng.
Hình 3.12 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm Termamyl 120L
Nhiệt độ và công suất siêu âm lần lượt là 30oC và 25 W/mL.
Trong khoảng thời gian siêu âm ban đầu, các dòng chảy rối có thể phá vỡ các liên kết hydro trong cấu hình không gian của phân tử protein enzyme theo chiều hướng giúp cho tâm hoạt động và tinh bột hòa tan dễ tạo phức với nhau thì sẽ làm tăng hoạt độ của chế phẩm amylase. Tuy nhiên, nếu càng kéo dài thời gian siêu âm, các liên kết hydro bị phá vỡ càng nhiều, dẫn đến cấu hình không gian của protein enzyme bị biến đổi quá mức, từ đó làm giảm hoạt độ enzyme [149], [150]. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm cellulase của Wang và cộng sự (2012), chế phẩm dextranase của Bashari và cộng sự (2013) cũng cho quy luật tương tự. Khi thời gian siêu âm tăng, hoạt tính enzyme sẽ tăng đạt cực đại và sau đó sẽ giảm xuống [150], [149].
d. Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ α- amylase trong chế phẩm Termamyl 120L
Sự ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ α- amylase trong chế phẩm Termamyl 120L được khảo sát bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo mô hình quay bậc hai của Box – Hunter. Các giá trị biến đổi của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm (biến tự nhiên và mã hóa) theo ma trận quy hoạch thực nghiệm và kết quả thí nghiệm được trình bày trong Bảng 3.1.
- 61 -
Bảng 3.1 Ma trâ ̣n quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m và kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ α- amylase trong chế phẩm Termamyl 120L
STT
Biến tự nhiên Biến mã hóa Hoạt độ
α - amylase (HĐα) (Y1) (KU/mL) Nhiê ̣t đô ̣
(oC)
Công suất (W/mL)
Thời gian
(giây) Nhiê ̣t đô ̣ Công suất Thời gian
T P t X1 X2 X3
1 25 20 60 -1 -1 -1 148
2 35 20 60 +1 -1 -1 147
3 25 30 60 -1 +1 -1 142
4 35 30 60 +1 +1 -1 144
5 25 20 90 -1 -1 +1 147
6 35 20 90 +1 -1 +1 146
7 25 30 90 -1 +1 +1 146
8 35 30 90 +1 +1 +1 147
9 22 25 75 -1,682 0 0 147
10 38 25 75 +1,682 0 0 147
11 30 16.6 75 0 -1,682 0 147
12 30 33.4 75 0 +1,682 0 141
13 30 25 50 0 0 -1,682 145
14 30 25 100 0 0 +1,682 147
15 30 25 75 0 0 0 152
16 30 25 75 0 0 0 152
17 30 25 75 0 0 0 150
18 30 25 75 0 0 0 154
19 30 25 75 0 0 0 153
20 30 25 75 0 0 0 150
Kết quả giải bài toán quy hoạch thực nghiệm với hàm mục tiêu là hoạt độ α – amylase trong chế phẩm enzyme Termamyl 120L được trình bày ở Bảng 3.2
Phương trình (3.1) và (3.2) mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong mẫu siêu âm theo biến mã hóa và biến tự nhiên.
𝑌1= 151,63 − 1,48𝑋2+ 0,89𝑋3− 0,97𝑋12− 2,01𝑋22− 1,50𝑋32+ 1,35𝑋2𝑋3 (3.1)
𝐻Đ𝛼= 91,11 + 0,58𝑇 + 2,44𝑃 + 0,61𝑡 − 0,01𝑇2− 0,08𝑃2− 0,01𝑡2+ 0,02𝑃. 𝑡 (3.2) Vì Ftính = 3,35 < F1-p(f1,f2)= F0,95(8,5) = 4,818 nên phương trình hồi quy tương thích với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher.
- 62 -
Bảng 3.2 Các hệ số của phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm enzyme Termamyl 120L theo biến mã hóa
Hệ số Giá trị bij Std. Err. p Ghi chú
bo 151,63 0,54 0,00 Nhận
b1 -0,14 0,30 0,64 Loại
b2 -1,48 0,30 0,00 Nhận
b3 0,89 0,30 0,01 Nhận
b11 -0,97 0,25 0,00 Nhận
b22 -2,04 0,25 0,00 Nhận
b33 -1,50 0,25 0,00 Nhận
b12 0,10 0,34 0,76 Loại
b13 0,17 0,34 0,61 Loại
b23 1,35 0,34 0,00 Nhận
Hệ số bij sẽ được nhận khi p < 0,05
Hình 3.13 Mối tương quan giữa hoạt độ α - amylase xác định bằng thực nghiệm và theo phương trình hồi quy
Ðộ tương quan giữa hoạt độ α – amylase thu được từ thực nghiệm và hoạt độ α – amylase tính toán từ phương trình hồi quy là 93 % (Hình 3.13). Như vậy có thể kết luận rằng mô hình hồi quy đã mô tả đúng các kết quả thực nghiệm trong khoảng khảo sát. Hệ số tương quan cho biết 93% sự biến đổi hoạt độ α – amylase là do ảnh hưởng của các biến độc lập X1, X2 và X3 và chỉ có 7 % sự thay đổi là do các yếu tố không xác định gây ra.
Phương trình hồi qui theo biến mã hóa (3.1) cho thấy các yếu tố ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến hoạt độ α – amylase bao gồm bậc 1 của công suất và thời gian siêu
- 63 -
âm; bậc 2 của cả nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm và chỉ bị ảnh hưởng tương hỗ của cặp yếu tố công suất - thời gian siêu âm.
Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố và tác động tương hỗ của các yếu tố đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm Termamyl 120L được trình bày trong Hình 3.14. Từ trái qua phải, mức độ ảnh hưởng của các yếu tố giảm dần. Trong đó, tác động bậc một của công suất và tác động bậc hai của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm là âm tính.
Điều đó các nghĩa là khi tăng nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm so với điểm tâm của mô hình (30oC, 25W/mL chế phẩm, 75 giây) thì hoạt độ α - amylase sẽ giảm xuống.
Ngược lại, ảnh hưởng bậc một của thời gian siêu âm và ảnh hưởng đồng thời của công suất - thời gian siêu âm có tác động dương.
Hình 3.14 Mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất, thời gian siêu âm và tương tác giữa chúng đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm enzyme Termamyl 120L
Ảnh hưởng đồng thời của ba yếu tố nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ α- amylase được biểu diễn trong Hình 3.15. Theo đó, chỉ có sự ảnh hưởng đồng thời của công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ α – amylase là có ý nghĩa về mặt thống kê. Với thời gian siêu âm là 60 giây, khi tăng công suất siêu âm từ 22W/mL lên 30W/mL thì hoạt độ α – amylase sẽ thấp hơn trường hợp xử lý siêu âm với thời gian là 90 giây. Tuy nhiên, trong khoảng công suất siêu âm 20 – 22W/mL thì thu được kết quả ngược lại: trường hợp siêu âm 60 giây cho hoạt độ α- amylase cao hơn so với trường hợp siêu âm là 90 giây.
- 64 -
Hình 3.15 Bề mặt đáp ứng của hoạt độ α- amylase khi thay đổi đồng thời công suất và thời gian siêu âm
Giải phương trình hồi quy theo biến tự nhiên (3.2) bằng công cụ Optimizer của chương trình Modde 5, giá trị hoạt độ α- amylase cực đại thu được là 151,7 KU/mL khi nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm lần lượt là 30,250C, 24,75W/mL và 77,25 giây.
Thực hiê ̣n thí nghiê ̣m ta ̣i điểm gần điều kiện cực tri ̣, với nhiệt độ siêu âm 300C, công suất siêu âm 25 W/mL và thời gian siêu âm 75 giây, kết quả cho thấy chế phẩm enzyme
- 65 -
siêu âm có hoạt độ là 152 1 KU/mL. Giá trị này tương đương với giá tri ̣ lý thuyết tính từ phương trình hồi quy. Như vâ ̣y, có thể kết luận rằng điều kiê ̣n xử lý siêu âm để làm tăng hoạt tính enzyme nhiều nhất là ở nhiệt độ 300C, công suất 25W/mL trong thời gian 75 giây, khi đó hoạt độ α- amylase là 152 ± 1 KU/mL, tăng 47,3% so với mẫu đối chứng.
e. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến cấu trúc enzyme α – amylase trong chế phẩm Termamyl 120L
Để có thể hiểu rõ hơn nguyên nhân làm thay đổi hoạt tính của enzyme, sự thay đổi hàm lượng protein hòa tan, thành phần protein, phổ UV- VIS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ hồng ngoại của mẫu siêu âm (chế phẩm Termamyl 120L được xử lý siêu âm ở nhiệt độ 30oC, công suất 25W/mL trong thời gian 75 giây) được so sánh với mẫu đối chứng (chế phẩm Termamyl 120L không có qua xử lý siêu âm).
Bảng 3.3 cho thấy không có sự khác biệt về hàm lượng protein hòa tan trong mẫu siêu âm và mẫu đối chứng. Như vậy sóng siêu âm đã làm tăng hoạt độ α – amylase nhưng không làm thay đổi hàm lượng protein hòa tan của chế phẩm Termamyl 120L.
Bảng 3.3 Hàm lượng protein hòa tan của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng
Mẫu Hàm lượng protein hòa tan
(mg/mL chế phẩm)
Đối chứng 15,726±0,037a
Siêu âm 15,790±0,037a
Các số liệu cùng nằm trong một cột mang chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa theo phân tích thống kê (p>0,05)
Kết quả phân tích quang phổ UV – VIS trong vùng bước sóng 190 – 300nm của mẫu đối chứng và mẫu siêu âm hầu như không có sự khác biệt (Hình 3.16).
Hình 3.16 Phổ UV – VIS của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng
- 66 -
Kết quả điện di (Hình 3.17) cho thấy rằng chỉ có một vạch protein và vị trí vạch của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng đều tương đương với phân tử lượng 58kDa. Như vậy sóng siêu âm không phân cắt phân tử protein enzyme để sinh ra các mạch phân tử ngắn hơn. Kết quả này có thể khẳng định nguyên nhân làm thay đổi hoạt độ α – amylase của chế phẩm Termamyl 120L không phải do biến đổi khối lượng phân tử enzyme.
Hình 3.17 Kết quả điện di của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng Từ kết quả phân tích hàm lượng protein hòa tan, thành phần protein và phổ UV, chúng ta có thể kết luận: Trong điều kiện thí nghiệm này, sóng siêu âm không làm thay đổi cấu trúc bậc một của enzyme. Nguyên nhân làm thay đổi hoạt độ enzyme có thể là do sự thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme, liên quan đến cấu trúc bậc hai hay bậc ba.
Kết quả phân tích mẫu bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) được trình bày trong Hình 3.18. Số lượng peak của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng đều không thay đổi, điều này chứng tỏ là số nguyên tử H trong phân tử enzyme của mẫu siêu âm và đối chứng không thay đổi dưới tác động của sóng siêu âm. Tuy nhiên, độ dịch chuyển và cường độ các peak của mẫu siêu âm có sự khác biệt so với mẫu đối chứng. Điều này chứng tỏ có sự thay đổi liên kết hydro trong cấu trúc phân tử enzyme dưới tác động của sóng siêu âm [156], [157]. Kết quả phân tích 1H-NMR là phù hợp với các kết quả điện
- 67 -
di: Sóng siêu âm không có thay đổi cấu trúc bậc một mà chỉ gây ra sự thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme.
Hình 3.18 Phổ 1H-NMR của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng
Hình 3.19 Phổ IR của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng Phổ hồng ngoại IR cho thấy số peak của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng hoàn toàn không thay đổi trong vùng 1200 – 1800cm-1. Tuy nhiên có sự thay đổi về cường độ các peak, có nghĩa là cấu trúc không gian của phân tử enzyme có thay đổi (Bảng 3.4).
Tỷ lệ cấu trúc α – helix và random coil tăng lần lượt 19,4% và 40,1%; ngược lại tỷ lệ cấu trúc β – sheet và β – turn giảm lần lượt là 4,2 và 11,8%. Cấu trúc bậc hai của protein được thể hiện qua vị trí và cường độ các đỉnh peak của các nhóm amide [158]. Các amide I và II có vị trí peak nằm trong khoảng tần số 1400 – 1700cm-1 [159], [160]. Theo Krimm và Bandekar (1986) [158]; Banker (1992) [161]: có 7 loại amide với các đỉnh peak khác nhau trên phổ IR; trong đó, quan trọng nhất là amide I và amide II vì chúng sẽ quy định cấu trúc xoắn α và cấu trúc gấp nếp β trong cấu trúc bậc hai của protein. Độ truyền suốt (hay độ hấp thu) tại các vùng amide khác nhau sẽ cho biết thông tin về cấu
- 68 -
trúc không gian đặc trưng của phân tử enzyme [162]. Thông thường amide I có đỉnh hấp thu nằm trong khoảng 1600 – 1690cm-1, đây là loại amide đặc trưng cho cấu trúc gấp nếp β trong phân tử enzyme. Amide II thường có đỉnh peak hấp thu nằm trong khoảng 1400 – 1575cm-1 và đặc trưng cho cấu trúc xoắn α trong cấu trúc của phân tử enzyme [163].
Bảng 3.4 Biến đổi cấu trúc bậc hai của chế phẩm enzyme trước và sau siêu âm
Mẫu
Tỷ lệ các dạng cấu trúc (%)
Nếp gấp β Xoắn α β turn Xoắn ngẫu nhiên
(Random coil)
Đối chứng 53,5a 15,0a 25,7a 5,9a
Siêu âm 51,2b 17,9b 22,7b 8,2b
Các số liệu cùng nằm trong một cột mang chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa theo phân tích thống kê (p>0,05)
Trước đây, khi nghiên cứu xử lý chế phẩm cellulase ở tần số 24 kHz, công suất siêu âm 15W trong 10 phút, Wang và các cộng sự (2012) nhận thấy hoạt độ enzyme tăng 18,2% và tỷ lệ xoắn α giảm từ 26,2% xuống 23,4% và nếp gấp β giảm từ 26,6%
xuống 25%, trong khi đó dạng cấu trúc β – turn tăng từ 21,9% lên 23,7% và cấu trúc xoắn ngẫu nhiên (random coil) tăng từ 24,8% lên 32,1%. Nếu xử lý với sóng siêu âm có tần số 29 kHz, công suất 50W trong 30 phút thì hoạt độ enzyme giảm 37% và tỷ lệ giữa các dạng cấu trúc xoắn α, nếp gấp β, β – turn và xoắn ngẫu nhiên cũng thay đổi lần lượt thành 27,6%, 26,4%, 23,5% và 22,2% [150]. Kết quả nghiên cứu của Subhedar và Gogate (2014) cũng cho kết quả tương tự, sóng siêu âm làm thay đổi tỷ lệ giữa các nhóm cấu trúc bậc hai làm hoạt độ cellulase tăng [164]. Bashari và cộng sự (2013) xử lý siêu âm chế phẩm dextranase và thu được kết quả ngược lại: hoạt độ của dextranase tăng 13,5% khi tỷ lệ cấu trúc dạng xoắn α tăng từ 19,7% lên 22%; dạng nếp gấp β giảm từ 24,1% xuống 23,5%; β – turn và xoắn ngẫu nhiên giảm lần lượt từ 19,2% xuống 18,7%
và 37,0% xuống 35,0% [149].
Quy luật rút ra được từ các thí nghiệm trình bày trong mục 3.2.1.1 là: sóng siêu âm có thể làm thay đổi hoạt độ α – amylase trong chế phẩm Termamyl 120L. Tùy theo giá trị của các yếu tố nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm mà hoạt độ α – amylase có thể không đổi, tăng hay giảm so với ban đầu. Hoạt độ α – amylase tăng cao nhất là 47,3%
so với mẫu đối chứng khi nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm lần lượt là 30oC,