Phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất 2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở 2 bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch sulfuric acid 10%

được phân bố đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.

2.2.1.2. Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel với kích thước hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh); pha đảo sử dụng loại RP-18 có cỡ hạt là 30-50

m (Fujisilysia Chemical Ltd.); Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.).

2.2.1.3. Tinh chế các hợp chất

Các hợp chất được tinh chế bằng sắc kí cột; kết tinh. Đối với các hợp chất khó tinh chế thì sử dụng thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1290, cột J’sphere H-80 kích thước 20 × 150 mm. Tùy vào bản chất (độ phân cực) của chất mà lựa chọn các điều kiện dung môi thích hợp để phân tách các hợp chất.

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định trên cơ sở sử dụng các phép xác định thông số vật lý và các phương pháp đo phổ bằng các thiết bị hiện đại đồng thời kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo. Các phương pháp đo được sử dụng gồm có:

2.2.2.1. Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS)

Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy FT-ICR-Mass spectrometry tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS tại Viện Hóa sinh biển và trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc.

2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR)

Phổ NMR được đo trên máy đo trên máy cộng hưởng từ Jeol EA600, Varian 400 MR, Brucker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội là TMS) tại trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc và Viện Hóa học.

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều: HSQC, HMBC, COSY và NOESY.

Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi CDCl3, C5D5N, CD3OD, DMSO-d6. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo nguyên tắc dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử.

Phổ 1H-NMR

Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hóa học (δH) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 -14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin-spin.

Phổ 13C-NMR

Phổ này cho biết thông tin tín hiệu phổ vạch carbon. Mỗi nguyên tử carbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang độ rộng 0-230 ppm.

Phổ DEPT (Distortionless Enhancement By Polarisation Transfer) Phổ này cho biết thông tin tín hiệu phân loại các loại carbon khác nhau. Trên phổ DEPT 900 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH. Trên phổ DEPT 135o, carbon bậc 4 không có tín hiệu, tín hiệu CH và CH3 quay lên phía trên và CH2 quay xuống phía dưới.

Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)

Phổ HSQC cho biết tín hiệu các tương tác trực tiếp H-C trong phân tử. Trên phổ một là trục phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR.

Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)

Phổ HMBC cho biết thông tin tín hiệu các tương tác xa của các dị hạt nhân qua 2-3 liên kết. Phân tích các tín hiệu trên phổ này sẽ quy kết được từng phần hoặc toàn bộ cấu trúc trong phân tử.

Phổ COSY (Correlation Spectroscopy)

Phổ này cho biết thông tin tín hiệu của các proton liên kết trực tiếp với carbon liền kề nhau. Phân tích phổ này sẽ gắn kết được các phần cấu trúc trong phân tử ghép nối với nhau.

Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)

Phổ này cho biết tín hiệu của các proton tương tác trong không gian không bị

che khuất. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian/cấu hình của nguyên tử/nhóm nguyên tử trong phân tử.

2.2.2.3. Phổ lưỡng sắc tròn (CD)

Phổ CD được đo trên máy ChirascanTM CD spectrometer (Applied Photophysics Ltd., Surrey, UK) tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Đại học Quốc Gia Seoul, Hàn Quốc.

2.2.2.4. Độ quay cực ([α])

Độ quay cực được đo trên máy JASCO P-2000 polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học

2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư Nguyên tắc

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được đánh giá theo phương pháp MTT được mô tả lần đầu tiên vào năm 1983 bởi Tim Mosman và sửa đổi bởi Alley [53].

Đây là phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào ung thư thông qua khả năng khử 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) màu vàng thành phức hợp formazan (màu tím đen) bởi hoạt động của enzyme dehydrogenase trong ty thể. Xác định phức màu trong mẫu thử sử dụng thiết bị đo mật độ quang tại bước sóng 540 nm

Thí nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Quốc Gia Chung Nam, Hàn Quốc và Khoa Dược, Đại học Yonsei, Hàn Quốc. Các dòng tế bào ung thư do Trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc cung cấp.

Các tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung 10% FBS, 100 U/mL penicillin và 100 àg/mL streptomycin trong điờ̀u kiện 37oC và

CO2 5%. Thí nghiệm MTT được tiến hành như sau: các tế bào ung thư người (3x105 tế bào/mL) được xử lý với 0,01, 0,1, 1, 10, 50 và 100 àM của mẫu thử (cỏc hợp chất và chất đối chứng dương, mitoxantrone) trong 3 ngày. Ngoài ra, các giếng tế bào được xử lí tương tự chỉ với DMSO 1% và giếng tế bào khác để làm đối chứng trắng.

Sau thời gian ủ, 0,1 àg MTT được thờm vào mỗi giếng và ủ trong 4h ở 37oC. Cỏc đĩa tế bào sau đó được ly tâm ở tốc độ 1000 rpm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đú mụi trường nuụi cấy được hỳt bỏ. dimethylsulfoxide (150 àL) được thờm vào mỗi giếng để hòa tan các tinh thể formazan. Các đĩa sau đó được đọc ở bước sóng 540 nm sử dụng máy đọc micro-plates (Amersham Pharmacia Biotech., USA). Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và tính toán giá trị trung bình.

Kết quả tính được là phần trăm ức chế-thể hiện bằng sự giảm hấp thụ của các mẫu được xử lý với chất thử so với đối chứng không được xử lý với chất thử.

Đường cong hoạt tính theo nồng độ được xây dựng và nồng độ gây ức chế 50% tế bào được xác định cho mỗi hợp chất. Cách tính toán một số các giá trị như sau:

Giá trị CS: Khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử so với đối chứng, tính theo %. Dựa trên kết quả đo giá trị OD (mẫu trắng), DMSO 1%

và giá trị OD khi thêm mẫu thử để xác định giá trị CS (%) theo công thức:

𝐶𝑆% = OD (mẫu) − OD (trắng)

OD (DMSO) − OD (trắng)× 100

% ức chế = 100% -CS%

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, được đưa vào tính toán Excel để tìm ra giá trị trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn () của kết quả phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau:

 = √∑(𝑥𝑖−𝑥̅)2

𝑛−1

Cỏc mẫu cú biểu hiện hoạt tớnh (CS < 50%) ở nồng độ 100 àM sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50.

Giá trị IC50: Căn cứ theo giá trị CS (% sống sót tế bào) của 10 thang nồng độ chất thử. Dùng chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của giá trị CS và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50 theo cách tính thường quy.

2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase Nguyên tắc

Tyrosinase là một enzym xúc tác phản ứng trong quá trình tổng hợp melanin.

Để thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase, ta sử dụng phương pháp trắc quang để đo mật độ quang của enzym tyrosinase. Mật độ quang của enzym tyrosinase tỷ lệ với cường độ hoạt động của enzym tyrosinase. Mật độ quang của enzym tyrosinase càng giảm thì cường độ hoạt động của enzym tyrosinase càng giảm và ngược lại.

Cách tiến hành

L-tyrosine được sử dụng làm cơ chất trong các thử nghiệm thử hoạt tính ức chế sự hoạt động của enzym tyrosinase theo quy trình như đã được công bố trước đây [54], [55]. Enzyme tyrosinase được mua từ hãng Sigma-Adrich là loại được chiết xuất từ nấm.

Hình 2.1. Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase

Trước tiên, các mẫu thử được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) tới nồng độ 10 mM. Sau đó pha loãng các mẫu thử với dung dịch đệm tới nồng độ cần thiết (1,0, 5,0, 10,0, 20,0 và 50,0 àM). Phộp thử được tiến hành trờn đĩa 96 giếng gồm cú 130 àl dung dịch enzym tyrosinase (113,3 U/ml) pha trong đệm phosphat

130 àl dd enzym tyrosinase (113,3 U/ml)

50 àL dung dịch L-tyrosine (2,0 mM)

 Pha trong dung dịch đệm phosphat

 Pha trong DMSO MẪU THỬ

DUNG DỊCH GỐC (10mM)

DUNG DỊCH LÀM VIỆC (20 àl)

1M 5 M 10 M 20 M 50 M

ĐO QUANG 475 nm 1 phút/lần trong 20p

(50 mM, pH 6,5), 20 àl chất thử, và 50 àL dung dịch L-tyrosine (2,0 mM). Phản ứng được thực hiện ở 37°C, khả năng hoạt động của enzym được quan sát dựa trên sự biến đổi độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 475 nm liên tục trong suốt 20 phút (mỗi phút đo 1 lần). Thử nghiệm sử dụng dung dịch đệm được sử dụng như là đối chứng âm và thử nghiệm sử dụng acid kojic như là đối chứng dương. Các thử nghiệm được tiến hành 3 lần riêng biệt. Khả năng ức chế hoạt động của enzym tyrosinase được tính toán dựa trên sự chênh lệch về độ hấp thụ giữa các mẫu thử nghiệm và mẫu đối chứng âm.

Số liệu được thể hiện giá trị trung bình ± sai số.

Mỗi phút đo 1 lần tại bước sóng 475 nm (liên tục trong suốt 20 phút) Phương pháp xử lý số liệu

Các phân tích được tiến hành lặp lại 2 lần để đảm bảo thực hiện phân tích ANOVA. Các số liệu được lấy từ các kết quả độc lập, thể hiện ý nghĩa bằng ± SD và được phân tích trên phần mềm GraphPad 6.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, U.S.A.). Kiểm định Dunnett được thực hiện sau phân tích ANOVA để đánh giá sự khác nhau của các giá trị với mức ý nghĩa p < 0,05.