Để xác định công thức phân tử của các phức chất tổng hợp được trong luận văn này, chúng tôi sử dụng phương pháp phổ khối lượng.
Cấu tạo của các phức chất và cách phối trí của các phối tử tổng hợp được nghiên cứu bằng cách sử dụng các phương pháp phổ hiện đại như: Phổ hấp thụ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C và phổ hấp thụ electron.
Hoạt tính sinh học của các phối tử và phức chất tạo ra đều được thử để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học cao có thể làm đối tượng nghiên cứu ứng dụng trong y học và dược học. Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm qua chỉ số IC50 và MIC.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong tổng hợp đều là các hóa chất tinh khiết.
STT Tên hóa chất Trạng thái tập hợp Xuất sứ
1 N(4) - metylthiosemicacbazit Rắn Merk (Đức)
2 2 - axetylpyriđin Lỏng Merk (Đức)
3 PdCl2 Rắn Anh
4 NiCl2.6H2O Rắn Trung Quốc
5 ZnCl2 Rắn Trung Quốc
Một số hóa chất dùng làm dung môi hay chất chỉ thị được sử dụng đều là các hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích của Trung Quốc. Các dụng cụ thí nghiệm
và quá trình tổng hợp được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa sinh vô cơ, Bộ môn Hóa vô cơ - Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.1.3. Kỹ thuật thực nghiệm 2.1.3.1. Các điều kiện ghi phổ
Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) của các phức chất và phối tử được ghi trên máy quang phổ IRAffinity – 1S của hãng Shimadzu trong vùng từ 4000 - 400 cm-1 tại Bộ môn Hoá Vô cơ - Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1H và 13C được ghi trên máy Avance - 500 MHz (Bruker) ở 300 K, trong dung môi DMSO, tần số ghi phổ cộng hưởng từ proton là 500 MHz, tần số ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C ở 125 MHz tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ khối lượng (MS) được ghi trên máy Varian MS 320 3Q - Ion Trap theo phương pháp ESI tại Phòng cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Dung môi được sử dụng là DMF, điều kiện ghi mẫu: vùng đo m/z : 50 - 2000; áp suất phun mù 30 psi; tốc độ khí làm khô 8 lit/ph; nhiệt độ làm khô 325oC; tốc độ khí 0,4 ml/ph; chế độ đo possitive.
Hoạt tính sinh học của các hợp chất được thử tại Phòng thử hoạt tính sinh học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.3.2. Thăm dò khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của các phối tử và các phức chất
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ của Vanden Bergher và Vlietlinck hiện đang được áp dụng tại trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC
(nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế 50%) và MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).
Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm các vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người:
Vi khuẩn Gr (+):
- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh.
- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật.
Vi khuẩn Gr (-) :
- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật.
Nấm men:
- Candida albicans: là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Môi trường duy trì và bảo tồn giống:
Sabouraud Dextrose Broth (SDB)-Sigma cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong môi trường Trypcase Soya Broth (TSB)-Sigma.
Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.
Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO (Đimethyl sulfoxide) và nước cất vô trùng thành một dãy 05 nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất là 128 g/ml, tiếp theo là 32 g/ml, 8 g/ml, 2 g/ml, 0,5 g/ml.
Lấy 10 l dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng, thêm 200
l dung dịch vi khuẩn và nấm, ủ ở 37oC. Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường.
Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.