3.1. Tối ƣu các điều kiện xác định anthocyanin trên hệ thống HPLC
3.1.5. Khảo sát thành phần pha động
Trong s c ký pha đảo, các dung môi được l a chọn phổ biến là nước, acetonitril và metanol. Các pha động khác nhau c độ phân c c khác nhau dẫn đến khả năng r a giải khác nhau. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát thành phần pha động là nước với acetonitril hoặc metanol cho thấy ở bất kỳ tỉ lệ nào c a nước với acetonitril hoặc metanol đều không r a giải được các anthocyanin.
AU
0.0000 0.0005 0.0010 0.0015 0.0020
Minutes
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00
Hình 3.6: Sắc ký đồ rửa giải các anthocyanin với thành phần pha động là nước và ACN Do cấu tạo c a các anthocyanin c nhiều nh m OH nên đ r a giải các anthocyanin ra khỏi cột C18 thì pha động phải c độ phân c c cao. Tham khảo một số tài liệu [31], [38], chúng tôi l a chọn 2 a it là axit axetic và axit trifloaxetic thêm vào thành phần pha động cho kết quả như sau:
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến độ rộng đáy pic (W), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS) của del, cya, pel.
Thành phần pha
động
Delphinidin Cyanidin Pelargonidin
tR (phút) W (phút) tR (phút) W (phút) tR (phút) W (phút)
Axit axetic 0,05%
8,48 1,6 12,41 1,1 15,16 0,9
RS
2,9 2,7
Axit trifloaxetic
0,05%
8,96 1,1 13,37 1,0 17,35 0,8
RS 4,2 4,4
Nhận ét: Khi thành phần pha động c bổ sung axit axetic hoặc axit trifloaxetic thì các anthocyanin được r a giải ra khỏi cột. Tuy nhiên, khi s d ng axit trifloaxetic cho pic s c ký hẹp cân đối, độ rộng đáy pic nhỏ, độ phân giải giữa hai pic liền kề lớn. Điều này c th do pKa c a a it trifloa etic nhỏ hơn pKa c a axit axetic nên axit trifloaxetic c tính chất a it cao gấp 34 lần so với a it a etic. Do đ , chúng tôi l a chọn pha động ch a axit trifloaxetic.
3.1.6. Khảo sát nồng độ axit trong pha động
Sau khi l a chọn được thành phần pha động ch a axit trifloaxetic, chúng tôi khảo sát tỉ lệ axit trifloaxetic trong pha động với các nồng độ: 0,025%; 0,05%; 0,1%
thu được kết quả sau:
A B C
Hình 3.7: Sắc ký đồ del, cya tại các nồng độ axit trifloaxetic khác nhau A: 0,025%; B: 0,05%; C: 0,1%
Nhận ét: Khi nồng độ a it trong pha động tăng, các anthocyanin ra muộn hơn. Tại nồng độ a it 0,1% píc s c ký bị ch , pic t và tín hiệu giảm. Các cột s c ký C18 hiện tại c khoảng pH hoạt động từ 2-7. Dung dịch a it trifloaxetic 0,1% có pH
= 1,8-2 là khoảng pH giới hạn c a cột, làm cho hiệu l c c a cột giảm, khả năng r a giải và hình dạng pic kém. Mặt khác, khi hoạt động nhiều ở điều kiện pH thấp, tuổi thọ c a cột giảm. Do đ , chúng tôi không khảo sát tại các m c nồng độ a it > 0,1%.
Đ đảm bảo độ nhạy, hình dạng pic s c ký cân đối, chúng tôi l a chọn nồng độ a it trong pha động là 0,05%.
3.1.7. Khảo sát chương trình rửa giải
Cố định pha động bao gồm 2 thành phần tối ưu là acetonitril và axit trifloaxetic, chúng tôi tiến hành khảo sát chương trình r a giải. Trong s c ký lỏng c hai chế độ r a giải hiện nay là chế độ isocratic (đẳng dòng) và gradient. Chế độ đẳng dòng c thành phần pha động được giữ cố định trong suốt quá trình chạy. Chế độ gradient c thành phần pha động thay đổi theo thời gian. Ở các tỉ lệ pha động khác nhau, l c r a giải khác nhau ph thuộc vào độ phân c c c a dung môi và thành phần dung môi theo công th c [8]:
PI = P1V1 + P2V2
Chế độ r a giải đẳng dòng:
S d ng chế độ r a giải đẳng dòng, thay đổi các tỉ lệ dung môi khác nhau thu được kết quả ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Rửa giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng Tỉ lệ
TFA 0,05% : ACN
PI
(đơn vị) Kết quả
75/25 9,06
3.007 3.357 4.215
AU
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
Minutes
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
85/15 9,64
90/10 9,74
AU
0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0012 0.0014
Minutes
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 26.00 27.00 28.00 29.00
Nhận ét: Tại tỉ lệ pha động là 90/10 với độ phân c c dung môi PI = 9,74 chưa r a giải được các anthocyanin ra khỏi cột. Tại tỉ lệ pha động 75/25 với độ phân c c dung môi PI = 9,06 đã r a giải được các anthocyanin nhưng chưa tách được hoàn toàn và pic s c ký bị doãng. Tỉ lệ 85/15 với độ phân c c dung môi PI = 9,64 các anthocyanin đã tách nhau tương đối rõ ràng nhưng pic pelargonidin ra chậm (19,3 phút) gây doãng pic (độ rộng chân pic gần 4 phút) làm giảm độ nhạy c a phương pháp. Như vậy, chế độ đẳng dòng không ph hợp đ tách các chất trong c ng nh m do tính chất và độ phân c c c a các chất gần nhau. Đ tách được hoàn toàn các anthocyanin trong thời gian ph hợp, chúng tôi khảo sát chương trình r a giải gradient.
Chế độ r a giải gradient: Chúng tôi tiến hành thay đổi chương trình r a giải gradient với hệ pha động CF3COOH 0,05 % - CH3CN.
Bảng 3.4: Chương trình gradient 1
Thời gian (phút) 0,01 10,00 15,00 15,10 23,00
% (A) dd CF3COOH 0,05 % 87 75 79 87 87
% (B) CH3CN 13 25 21 13 13
PI (đơn vị) 9,61 9,06 9,27 9,61 9,61
Hình 3.8: Sắc ký đồ của hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 1
Bảng 3.5: Chương trình gradient 2
Thời gian (phút) 0,01 10,00 15,00 15,10 23,00
% (A) dd CF3COOH 0,05 % 87 80 82 87 87
% (B) CH3CN 13 20 18 13 13
PI (đơn vị) 9,61 9,29 9,38 9,61 9,61
Hình 3.9: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 2 Bảng 3.6: Chương trình gradient 3
Thời gian (phút) 0,01 10,00 11,00 25,00
% (A) dd CF3COOH 0,05 % 90 80 75 90
% (B) CH3CN 10 20 25 10
PI (đơn vị) 9,74 9,29 9,06 9,74
Hình 3.10: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 3
Bảng 3.7: Chương trình gradient 4
Thời gian (phút) 0,01 10,00 11,00 11,10 20,00
% (A) dd CF3COOH 0,05 % 85 78 75 85 85
% (B) CH3CN 15 22 25 15 15
PI (đơn vị) 9,64 9,20 9,06 9,64 9,64
Hình 3.11: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 4 Nhận ét: Khi s d ng chương trình gradient, các anthocyanin đã tách nhau hoàn toàn, tuy nhiên hình dạng pic s c ký tại các chương trình khác nhau cho kết quả khác nhau. Đ đánh giá pic s c ký đẹp và cân đối, chúng tôi s d ng hệ số đối ng pic theo công th c:
A S B
A: khoảng cách từ chân đường vuông g c hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/10 chiều cao pic.
B: khoảng cách từ chân đường vuông g c hạ từ đỉnh pic đến mép đưòng cong phía sau tại vị trí 1/10 chiều cao pic.
S = 1,0 ÷ 1,05 là pic rất đẹp (lí tưởng) S = 1,5 là chấp nhận được
S = 2 là pic ấu S = 4 là pic rất ấu
Thu được bảng kết quả ở bảng 3.8.
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của chương trình gradient đến hệ số đối xứng pic Chương trình
gradient
Hệ số đối xứng pic (AS)
Del Cya Pel
Gradient 1 1,75 2,00 1,50
Gradient 2 1,50 1,20 1,50
Gradient 3 1,30 1,25 0,95
Gradient 4 1,00 1,01 1,02
Nhận xét: Bảng 3.8 cho thấy với chương trình gradient 4 cho kết quả pic s c ký có hệ số đối x ng pic là đẹp nhất. Do đ chúng tôi l a chọn chương trình r a giải gradient 4 s d ng hệ pha động là dung dịch axit trifloaxetic 0,05% - acetonitril đ tiến hành chạy s c ký.
3.1.8. Khảo sát tốc độ pha động
Tốc độ pha động cũng g p phần ảnh hưởng tới hiệu quả tách s c ký vì nó liên quan đến quá trình thiết lập cân bằng c a chất tan trong hai pha tĩnh và pha động.
Khi tốc độ pha động nhỏ, chất phân tích ra muộn, gây doãng pic, giảm độ nhạy và tốn dung môi. Khi tốc độ pha động quá lớn c th làm cho chất phân tích chưa tách ra khỏi nhau đã bị đ y ra khỏi cột dẫn đến hiện tượng chồng pic và gây áp suất lớn trong bơm. Ph hợp với thụng số cột (100 mm x 4,6 mm x 2,6 àm), chỳng tụi khảo sát khả năng tách c a các anthocyanin ở các tốc độ: 0,5 ml/phút; 0,4 ml/phút; 0,3 ml/phút thu được kết quả sau:
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thơi gian lưu và chiều cao pic Tốc độ dòng
(ml/phút)
Thời gian lưu Chiều cao pic
Del Cya Pel Del Cya Pel
0,5 ml/phút 8,715 10,301 12,381 90274 79019 110387 0,4 ml/phút 9,874 11,656 14,276 70037 58836 100140 0,3 ml/phút 11,541 13,405 16,676 60885 65836 99739
Nhận ột: Cột s c ký được s d ng là cột hạt nhỏ (2,6 àm) nờn ỏp suất đầu cột tương đối lớn. Đ đảm bảo độ bền c a cột và áp suất hệ thống, chúng tôi không khảo sát ở các tốc độ cao hơn 0,5 ml/phút. Với tốc độ dòng trong khoảng 0,3–0,5 ml/phút, khi tốc độ dòng giảm, thời gian lưu c a các anthocyanin giảm gây doãng