D a vào khả năng hòa tan c a anthocyanin và tham khảo nhiều bài báo [6], [10], [12] chúng tôi khảo sát khả năng chiết anthocyanin từ nền mẫu bằng cách th y phân mẫu ở nhiệt độ 500C, 600C, 700C, 800C với thời gian 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, bằng h n hợp dung môi sau đây: metanol- dung dịch axit clohydric 2 M với các tỷ lệ như sau: 90:10; 85:15; 80:20; 75:25.
Sơ đồ 1: Qui trình xử lý mẫu dự kiến
Quy trình chiết anthocyanin cho đối tượng phân tích là rau c d kiến gồm các bước sau:
- Đồng nhất mẫu: nghiền, ay mẫu.
- Cân chính ác khoảng 10 g mẫu sau khi đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml.
- Thêm khoảng 35 ml dung môi chiết h n hợp MeOH – dung dịch HCl 2 M vào ống ly tâm.
- L c vorte , rung siêu âm 15-30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Th y phân mẫu.
- Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút.
- Gạn lấy phần dịch trong, định m c 50 ml bằng c ng dung môi và lọc qua Cân ~10 g mẫu vào ống ly tâm 50 ml
Rung siêu âm (15-30 phút ở nhiệt độ phòng)
+ 30-35 ml MeOH:HCl 2 M L c vorte
Thuỷ phân mẫu, đ nguội
Ly tâm 6000 vòng/phút, 5 phút
Gạn dịch chiết vào bình định m c 50 ml, định m c đến vạch
Bơm 10 àl vào HPLC Đồng nhất mẫu: nghiền, ay mẫu
Lọc qua màng lọc 0,45 àm
màng lọc 0,45 àm.
- Bơm vào hệ s c ký HPLC (pha loãng nếu cần).
Trong quá trình th y phân, yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến kết quả c a mẫu phân tích là nhiệt độ và thời gian th y phân. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát hai yếu tố này.
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân
Anthocyanin là chất chống o y hoá dễ bị chuy n dạng bởi các yếu tố môi trường như: o y không khí, nhiệt độ, ánh sáng… Do đ , thời gian th y phân trong quá trình lý mẫu là rất quan trọng đối với việc nghiên c u này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian th y phân mẫu th c với mẫu là b p cải tím trong 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút và tiến hành chạy máy trong điều kiện lý d kiến như ở sơ đồ 1 với th tích định m c cuối c ng là 50 ml, cố định nhiệt độ thuỷ phân là 600C và tỉ lệ dung môi chiết MeOH:HCl 2 M = 85:15.
Hình 3.12: Hàm lượng các chất khi thủy phân trong thời gian khác nhau (60, 90, 120, 150 phút).
Bảng 3.10: Hàm lượng các chất theo thời gian thủy phân
Thời gian (phút)
Lƣợng cân mẫu
(g)
Thể tích định mức (ml)
Hệ số pha loãng
Diện tích pic (mAU)
Nồng độ chất phân tích trong dung dịch thử (ppm)
Hàm lƣợng chất phân tích
(mg/100 g)
Del
60 10,6649 50 1 95159 2,76 1,29
90 10,6013 50 1 97173 2,82 1,33
120 10,9061 50 1 100223 2,90 1,33
150 10,2999 50 1 79734 2,31 1,12
Cya
60 10,6649 50 1 2302013 54,04 25,34
90 10,6013 50 1 2506867 58,85 27,76
120 10,9061 50 1 2863425 67,22 30,82
150 10,2999 50 1 2599353 61,02 29,62
Pel
60 10,6649 50 1 296886 2,45 1,15
90 10,6013 50 1 313625 2,58 1,22
120 10,9061 50 1 326313 2,69 1,23
150 10,2999 50 1 291372 2,40 1,17
Qua đồ thị hình 3.12 và kết quả ở bảng 3.10 ta thấy: Ở thời gian 60 phút và 90 phút, chưa thuỷ phân được toàn bộ 3 chất. Ở thời gian 120 phút, hàm lượng các chất thu được là lớn nhất (đối với cả 3 chất). Ở thời gian 150 phút, hàm lượng 3 chất giảm c th do ảnh hưởng c a nhiệt độ, thời gian làm anthocyanin sau khi thuỷ phân bị phân huỷ. Do đ , chúng tôi sẽ chọn điều kiện thời gian th y phân là 120 phút trong các khảo sát tiếp theo.
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
Khảo sát nhiệt độ th y phân theo quy trình d kiến như ở sơ đồ 1 với thời gian th y phân 120 phút tại các nhiệt độ: 500C, 600C, 700C, 800C; với th tích định m c cuối c ng là 50 ml, cố định tỉ lệ dung môi chiết MeOH:HCl 2 M = 85:15.
Hình 3.13: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ thủy phân khác nhau
Bảng 3.11: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ thủy phân khác nhau
Nhiệt độ (0C)
Lƣợng cân mẫu
(g)
Thể tích định mức (ml)
Hệ số pha loãng
Diện tích pic (mAU)
Nồng độ chất phân tích trong dung dịch thử (ppm)
Hàm lƣợng chất phân tích
(mg/100 g)
Del
50 9,5522 50 1 22769 0,64 0,34
60 10,8217 50 1 27389 0,77 0,36
70 9,4100 50 1 20602 0,58 0,31
80 9,8620 50 1 26815 0,75 0,38
Cya
50 9,5522 50 1 2302013 54,04 28,29
60 10,8217 50 1 2693681 63,24 29,22
70 9,4100 50 1 2158794 48,98 26,03
80 9,8620 50 1 2362384 55,46 28,12
Pel
50 9,5522 50 1 250674 1,98 1,03
60 10,8217 50 1 281553 2,22 1,03
70 9,4100 50 1 236790 1,87 0,99
80 9,8620 50 1 270572 2,13 1,08
Như vậy theo kết quả thu được, th y phân tại nhiệt độ 800C cho hàm lượng các chất là lớn nhất. Do đ , chúng tôi sẽ chọn điều kiện nhiệt độ th y phân là 800C trong các khảo sát tiếp theo.
3.2.3. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu
D a trên bài báo [29] chúng tôi s d ng h n hợp dung môi MeOH:HCl 2 M với các tỷ lệ: 90:10; 85:15; 80:20; 75:25, đ chiết mẫu b p cải tím tại nhiệt độ th y phân 800C trong 120 phút theo quy trình d kiến như ở sơ đồ 1.
Hình 3.14: Hàm lượng các chất theo phần trăm HCl 2 M trong dung môi chiết mẫu Bảng 3.12: Hàm lượng các chất tại các tỷ lệ dung môi chiết khác nhau
Tỷ lệ MeOH:
HCl 2 N
Lƣợng cân mẫu
(g)
Thể tích định mức (ml)
Hệ số pha loãng
Diện tích pic (mAU)
Nồng độ chất phân tích trong dung dịch thử (ppm)
Hàm lƣợng chất phân tích
(mg/100 g)
Del
90:10 10,6358 50 1 165814 4,42 2,08
85:15 9,5705 50 1 180912 4,82 2,52
80:20 9,8526 50 1 191276 5,10 2,59
75:25 10,2504 50 1 160533 4,28 2,09
Cya
90:10 10,6358 50 1 2506020 55,36 26,02
85:15 9,5705 50 1 2650677 58,55 30,59
80:20 9,8526 50 1 2499423 55,21 28,02
75:25 10,2504 50 1 2225993 49,17 23,98
Pel
90:10 10,6649 50 1 282766 2,13 1,00
85:15 10,6013 50 1 332637 2,50 1,18
80:20 10,9061 50 1 335158 2,52 1,16
75:25 10,2999 50 1 267340 2,01 0,98
Như vậy theo kết quả thu được, tỷ lệ dung môi MeOH-HCl 2 M (85:15) cho hàm lượng các chất chiết được là lớn nhất. Do đ chúng tôi chọn tỷ lệ dung môi chiết mẫu là MeOH–HCl 2 M với tỷ lệ 85:15.
Kết luận: Từ các kết quả ở trên chúng tôi quyết định đưa ra quy trình chiết mẫu như sau:
Sơ đồ 2: Quy trình phân tích mẫu thực